質量分析入門

LC-MS 用の溶媒および注意事項

溶媒は通常、対象化合物の溶解度および LC-MS で使用するさまざまなイオン化手法との適合性に基づいて選択します。揮発性およびプロトンを供与する溶媒の能力が ESI およびその他の大気圧イオン化手法において重要です。

メタノールや水との混合物（1：1 水：メタノール、1：1 水：アセトニトリルなど）などのプロトン性一次溶媒を使用します（水：メタノール混合液は、発熱反応により、純粋溶媒である水やメタノールのいずれよりも粘度が高くなります）。水は蒸気圧が比較的低いため、100% の水を使用すると感度が下がる場合があります。揮発性有機溶媒を添加することで表面張力が小さくなると、感度が高まります。プロトン親和性の高い界面活性剤を使用すると、噴霧による液滴によりイオン遊離が増加し、感度が低下する可能性があります。

一部の化合物では、10% DMSO を含む水やイソプロピルアルコールなどの非プロトン性の共溶媒により溶解度が改善します。低濃度（0.1%）のギ酸を添加し、分析種の塩基性を溶媒よりも高くすることでイオン化を促進することもよく行われます。一方、TFA など一部の酸は、不溶性の化合物にその使用が必要ですが、少量でも感度が低下します。

ESI イオン化モードでは、バッファーおよび塩（Na⁺、K⁺、リン酸塩）により蒸気圧が低下し、シグナルが低下します。液滴の表面張力の上昇による揮発性の低下も、弱酸と弱塩基の対により生じる酢酸アンモニウムなど、相対的に揮発性の高いバッファーを使用することで対応できます。

溶媒取り扱い時の注意

気相中の溶媒では、溶媒よりも塩基性の強い分子に対する ESI により、イオン化が制限されます。光イオン化（酸/塩基イオン化ではない）は例外ですが、溶媒が媒介するという点では同じです。
イオン化領域から溶媒や水の蒸気を取り除くと、大気圧でイオン化する化合物の種類が増加します。
液体に含まれるサンプルまたは対象分析種に対する液体の相対量を減らすことで、ESI の性能（低流量など）が改善します。
有用な溶媒
- 水
- アセトニトリル
- メタノール
- エタノール
- プロパノール
- イソプロパノール
許容できる添加剤
- 酢酸
- ギ酸
- 水酸化アンモニウム
- ギ酸アンモニウム（塩濃度 = 10 mM 以下）
- 酢酸アンモニウム（塩濃度 = 10 mM 以下）
不揮発性塩（リン酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩など）
- イオン源に沈着し、キャピラリーが詰まる可能性があるため、より頻繁なクリーニングおよびメンテナンス操作が必要
- 最新のイオン源設計により、以前の設計よりも不揮発性物質の扱いが改善
界面活性剤（洗剤）はエレクトロスプレーイオン化を抑制
無機酸は腐食性
トリフルオロ酢酸（TFA）
- 0.01% を超える濃度で、一定のポジティブイオンエレクトロスプレーがある程度抑制
- ネガティブイオンエレクトロスプレーが大幅に抑制
トリエチルアミン（TEA）
- 高 PA（232 Kcal/mol）により、m/z 102 に強度の高い [M+H]+ イオンが発生
- 低塩基性化合物のポジティブイオンエレクトロスプレーを抑制
テトラヒドロフラン（THF）
- 100% THF は引火性が高いため、APCI および大半のインターフェース手法では、ネブライザーガスとして窒素を使用（空気を使用すると、爆発の危険が生じる）
- PEEK チューブと反応する

イオン化抑制およびケミストリーの選択

イオン化抑制は、ESI をイオン化手法として用いる場合に直面する目に見える問題です。米国食品医薬品局（FDA）の発行物 Guidance for Industry on Bioanalytical Method Validation（Federal.Register, 66, 100, 28526、2001 年）では、分析の品質を損なわないようにするために、このような注意事項の必要性を示しています。この論文には、イオン化抑制の有無を評価する実験プロトコールが複数記載されています。論文の 1 つでは、スパイクし、抽出した後のサンプル中のある分析種のマルチプルリアクションモニタリング（MRM）レスポンス（ピーク面積またはピーク高さ）を、純粋な移動相に直接注入した分析種の MRM レスポンスと比較しています。純粋な溶媒と比較して、マトリックス中の分析種のシグナルは低く、干渉物質の存在を示唆しています。

C. Mallet らによる論文には、ある分析種（および内部標準）に対してクロマトグラムにマトリックス効果が存在することが記載されています。この実験では、カラム溶出液に加えた対象の分析種とその内部標準を含む標準溶液の連続送液を使用しました。ブランクサンプルの抽出液を LC システムに注入した後、ベースラインが低下し続けたことから、干渉物質の存在による分析種のイオン化抑制が示されました。

カラムケミストリー

テクノロジーにおける有用な変化として、ハイブリッドカラムケミストリー、および直径 2 マイクロメートル未満の選択性の高い粒子の登場が挙げられます。ハイブリッドケミストリーは、イオン化抑制を引き起こす可能性のある移動相モディファイヤーにあまり依存せず、粒子の選択肢が広がっています。

超高圧 LC と従来の HPLC の比較

一般に UHPLC（超高速液体クロマトグラフィー）と呼ばれることの多い、J. Jorgenson 博士（米国ノースカロライナ大学）の最近の研究を製品化した装置は、通常の LC-MS 分析よりも多くの情報が得られる可能性があります。ウォーターズコーポレーションにより製品化された UPLC（超高速高分離液体クロマトグラフィー）では、HPLC と比較してピークキャパシティが向上しており、HPLC では幅広いピークとして共溶出していた化学物質の定義が可能です。ピークを（通常）2 秒以下の幅のバンドに凝縮することで、質量分析計のレスポンスがシグナル対ノイズ比の面で改善し、感度が高まる可能性があります。

UPLC の概念により、従来の分離の実践で確立され、これまで馴染んできたパラメーターである流量や粒子径、そしてファン・デームテル曲線の評価さえ変わります。動作圧力が約 2000 psi から最大 20,000 psi まで高まるとともに、2 µm 以下という粒子径は、1969 年に John Knox が「Knox 方程式」に記載した理論的限界に近付いています。かつて機械的応力、熱効果の増大に付随していた問題は、MS 性能の改善で対処され、多少直感とは反する理論の結果となりました。

ファン・デームテルプロットとして描画された線速度による効率の変化として見ると、直径 1.7 μm の粒子を充塡したカラムは、流速に関係なく性能が改善しています。

HPLC でよく見られるように、非常に低い線速度ではすべてのカラムにおいて性能が低下していますが、粒子径の小さなカラムのほうが性能が良く、線速度を上げても性能低下があまり見られません。

現在では「旧式」と見られている HPLC 分離と UPLC 分離を比較すると、UPLC テクノロジーにより、実験デザインのアプローチが再定義されたことが分かります。基本原理によって分離が再定義（分析時間が最大 4 分の 1 に短縮）されただけでなく、選択性が向上し、図中のミダゾラムの代謝物など、隠れていた詳細が明らかになりました。分離が改善したことは、2 番目のグルクロニド代謝物（m/z = 548.125）からわかります。