質量分析入門

初期創薬を超えるさまざまなアプリケーションにおける構造解析のための、増強され、評価された質量精度および分解能が今では有力なツールとなっています。四重極飛行時間型（QTOF）装置は、現在多数の製造者が販売しており、その幅広い特異性および可用性の範囲により、その他の LC-MS テクノロジーに代わるものとなっています。

さらに高次元の装置も存在しますが、QTOF 装置の高い質量精度は、数 ppm の単位で真の計算済みモノアイソトピック値の範囲内に入り（四重極型装置よりも分解能が 10 倍も高い）、質量欠損（存在する水素およびその他の原子の臨界質量値が差別化要因になる）に基づいて実験的に化学式を決定することができます。スペシエーション分析 — 四重極型装置の限界値よりも質量精度が 30 ppm（2 つの質量の間の差が 0.035 Da）向上したことにより、例えば、アルデヒドと硫化物の差を識別することが可能になりました。ただし、メチル化を含む代謝プロセス間の識別はより困難です。CH₂ が付加されると、測定される質量がプリカーサーと較べて +14.0157 Da 増加します（薬物のみに対するレスポンス）。一方、水酸化（酸素の追加）後に二重結合の酸化（H₂ の喪失）を含む 2 段階の生体内反応では +13.9792 Da 増加します。いずれの測定値も、通常の四重極のレスポンスである公称分解能に制限され、ほぼ +14 Da になります。

高質量精度および低分解能

低分解能四重極型装置は、タンパク質分析に使用される場合などで、非常に質量精度が高い性能を発揮します。タンパク質の質量は、複数の同位体ピークが互いに分離されない場合は一般的に、「平均」値で定義します。平均質量とは、分子に含まれるすべての同位体分子種の加重平均です。四重極型装置で通常使用されている装置の分解能により、10 kDa のタンパク質の分離レスポンスが 1.27 倍広くなります。この倍率は、質量が大きくなるにつれて大幅に大きくなります（例えば、100 kDa では 2.65 倍）。一方、通常のピーク幅（m/z 0.6）を使用すると装置の分解能が 1000 に制限されますが、ピーク幅を m/z 0.25 に減らすと（分解能が 4000 に増加）状況が大幅に改善します。

実際には、高分子の ESI-MS 分析では多価イオンが生成します。そのため、ピーク幅をイオンの電荷数で除算して、質量電荷比のスケールのピーク幅を求める必要があります。例えば、10 ～ 20 個の電荷を持つ 20 kDa のタンパク質では、それぞれ m/z が約 2000 または約 1000 で m/z 0.9 または 0.45 単位幅の同位体エンベロープが生成します。

同位体を分離するのに必要な分解能よりも大幅に分解能が低い装置（分解能が例えば 10,000 未満）でこれらのイオンを観察すると、それぞれのチャージ状態に対して単一のピークが生成します。全体的なピーク幅は、装置ピーク幅を同位体エンベロープの理論的ピーク幅をイオンの電荷数で除算した値と組み合わせて決定します。装置ピーク幅は、多価タンパク質のピークと同一の m/z 値を示す低分子量化合物の 1 番目の同位体ピークについて決定します。

どの程度の精度が必要でしょうか？その精度は現実的に達成可能でしょうか？妥協点は？

American Society for Mass Spectrometry（米国質量分析学界）の著者のガイドライン（2004 年 3 月）に記載されている明確な特性解析の要件を検討しましょう。C、H、O、N の組成（C_0-100、H_3-74、O_0-4、N_0-4）では、118 でのノミナル質量電荷比レスポンスが明確であるためには誤差が 34 ppm 以内であることのみが必要ですが、ここで「外部からの可能性をすべて」排除するには、m/z 750 でのレスポンスの精度が 0.018 ppm より高いことが必要です。

複数の装置間での精度（ミリ質量単位（mmu）、測定誤差（ppm）および分解能）の比較

英国国家計測システムの一部を構成するイニシアティブである VIMMS プログラムの Accurate Mass Best Practice Guide（精密質量のベストプラクティスガイド）によると、精密質量の測定に使用されている装置のほどんどでは 10 ppm 以上の精度が達成できます。

最新の質量分析計で測定された精度 2 mmu 以内の計算質量 118 Da では誤差 17 ppm が表示されますが、これは、その質量に対する化学式の明確な決定のための今日の標準に照らして十分です。

モノアイソトピック計算された精密質量 = 118 Da

測定された精密質量 = 118.002 Da

差 = 0.002 mmu

誤差（差/精密質量 x 106） = 17 ppm

m/z 750 でのレスポンスが 2 mmu 不足している装置の誤差は 2.7 ppm です。1 つ目のケースでは、Journal of The American Society for Mass Spectrometry に発表された規準によると、この測定値は化学式の明確な特定に必要な要件を十分満たしています。しかし 2 つ目のケースでは、測定値の精度が不十分です。高次のフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（FTICR）でのみ、高質量でこのレベルの精度を達成できます。

用途が類似する装置の質量精度測定能力を評価する包括的な方法として、二乗平均平方根（RMS）誤差の計算があります。その使用を分かりやすく示すため、市販の TOF 質量分析計の質量測定精度の仕様から、以下を適用しました。

「装置の質量測定精度は、通常の動作条件下では、適切なレファレンスピークを使用した（特定の m/zの）分析種のピーク（特定の m/zの）の連続した繰り返し測定の数に基づき、特定の ppm RMS （特定の m/z 範囲にわたって）よりも高くなる。分析種およびレファレンスピークは、強度が十分で、他の質量からの干渉がないことが必要である。」

他にも検討すべき重要な点および前提がいくつかあります。

1. キャリブレーション標準を使用して、既知の質量ピークについて装置のキャリブレーションが実施済みであること。レファレンスピークを使用して、装置のキャリブレーションの経時的なばらつきを考慮しており、分析種のピークを用いて質量測定精度が決定されていること。
2. 通常の動作条件 - これには、クロマトグラフィー条件の詳細（LC-MS 性能仕様の場合）や関連する MS 動作条件（質量分解能、目的 m/z、スペクトル取り込みレートなど）が含まれる場合もあります。
3. 十分な強度 - イオン数が（質量測定）の精度および問題の装置の精度の特性解析に悪影響を及ぼさないと仮定します。イオンが少なすぎるとイオン統計が悪くなり、イオンが多すぎると検出器が飽和します。いずれの場合も繰り返し測定の標準偏差のばらつきが大きくなり、RMS 誤差の計算に悪影響を及ぼします（装置のキャリブレーションにも関連）。
4. 干渉がないこと - 質量既知のピークの質量測定に同じ質量または類似した質量のイオンによる干渉がないと仮定します。重なったピークでは質量測定の精度が下がり、装置の正確性や精度の適切な特性解析ができなくなります（装置のキャリブレーションにも関連）。
5. レファレンスは、特定のサンプルの種類の分析に関連する m/z 範囲を良く表します。

RMS 誤差は以下の関係を用いて計算します。ここで、E_ppm は ppm 誤差、n は考慮する質量の数です。

特筆すべき点として、RMS 誤差により、一部の測定値が ppm 誤差の「対象の枠」外（例：5 ppm RMS）になってしまうことが挙げられます。質の高い測定を確実に行うには、多数の繰り返し注入にわたって上述の条件を満たす必要があります（特に、強度および干渉の影響 - スペクトル中の明確なピーク定義によるバランスの取れたイオン統計）。報告されている分解能および質量精度の数字の多くは、RMS 誤差の数字ではなく、選択した単一の（望ましい）イオンに由来するものです。

あらゆるアプリケーションにおいて、弱いシグナル（過剰に高い分解能）によりイオン統計が悪くなり使用できなくなる場合があることに留意が必要です。シグナルが強すぎる場合も、検出器が飽和状態になり、同様に使用できません。イオン統計が理想的にバランスが取れ、スペクトルで定義できることが目標です。

図に関する比較：

• 四重極の分解能は、上の図の 2 化合物を区別するのに十分ではありません。
• 分解能約 5,000 の TOF データでは、2 つのピークが明確に示され、質量が 5 ppm 未満の誤差で正確に測定できます。

質量の定義の間でのシフト、分解能の向上、ピーク形状やキャリブレーションなどの要因が精密質量の精度において果たす、相互に関連しているさまざまな役割を理解することが重要です。これを明確に理解せず、質量の誤割り当てを考慮しないと、その他の望ましくない結果が生じる可能性があります。

図中の組成が異なる 2 つのフラグメントは、同一の分析種に由来し、したがってイオン源に同時に存在するものです。この場合は、最善のクロマトグラフィーでも役に立たず、特に未知化合物の分析においては、高分解能が有用である理由が浮き彫りになります。このことは QTof のプロダクトイオンデータとトリプル四重極で得られるプロダクトイオンデータの比較にも当てはまります。高分解能のさらなるメリットとして、それぞれの抽出イオンカレント（XIC）プロットにより、酸素を含む分析種とアルキルを含む分析種がクロマトグラムから選択的に区別できます。四重極のデータにはこの機能がありません。

参照文献 MS – The Practical Art, LCGC

• Debating Resolution and Mass Accuracy, Vol.22 No.2, 118 – 130, February 2004
  • 重要である理由：使用における実用的な側面から多くの問題を取り扱っており、業界からの情報をもとに比較を行っています。
    
• Petroleomics: MS from the ocean floor, Vol.26, No.3 March 2008
  • 重要である理由：最高の分解能の装置の有用性を説明し、現実的な期待から比較しています。

関連項目：

• Methodology for Accurate Mass Measurement of Small Molecules, K. Webb, T. Bristow, M. Sargent, B. Stein, Department of Trade and Industry’s VIMMS Program within the UK National Measurement System, (LGC Limited, Teddington, UK 2004).VIMMS 2004 guidance document
  • 重要である理由：測定された精密質量の測定作業の成功を左右する問題の簡潔な概要。
    
• Dealing with the Masses: A Tutorial on Accurate Masses, Mass Uncertainties, and Mass Defects, A. D. Leslie and D. A Volmer, Spectroscopy, Vol.22, No.6 June 2007
  • 重要である理由：ケンドリック質量欠損法およびペプチドとタンパク質の標識を含む基本的なトピックを掘り下げています。

スルファメタジン公称 = 278

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

平均質量 – 各元素のすべての同位体およびその天然存在量を使用して計算。

スルファメタジン平均質量 = 278.3313

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

計算された精密質量 – （モノアイソトピック）。あるイオンの個々の同位体の質量を合計して決定。

スルファメタジンの精密質量 = 278.0837

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

精密質量 – （実際には「測定された精密質量」）。装置で測定するもの。m/z の目安で、（通常は）小数点以下 3 ～ 4 桁まで報告。

質量が増加すると、定義の差が大きくなり、ピーク形状がより大きな役割を担います。

ユビキチンのノミナル正確平均

[C₃₇₈H₆₃₀N₁₀₅O₁₁₈S] 8556 8560.6254 8565.8730