離脱およびソフトイオン化により生成するスペクトルの特性解析
よく特性解析された特異的フラグメンテーションに至る、古くから知られているディールス–アルダー反応および結合の切断に必要な均等/不均等結合開裂エネルギーが、今でもマススペクトルの考え方の基礎となっています。解釈の規則の理解において重要な貢献をした 1 人である Fred W. McLafferty が投じた「取り扱っている質量は何か？」という質問に答えることが MS ではしばしな困難になります。
マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）やエレクトロスプレーなどの脱離手法が開発されるまで、少なくとも当時は、この質問に容易に回答できることがありました。分析の容易さは、サンプルを誘導化して気化させ、GC-MS で分析できるようにする必要があるかどうかによって決まりました。この場合、スペクトルは誘導体化基がほとんどになり、分子イオンはほとんど現われませんでした（そのため、Cｌ が必要になりました）。このケースでは、エレクトロスプレーや APCI の登場により、一価の低分子化合物の分子量の特定が容易になりました。少なくともこのような場合、MS では一価のみを示すイオンの m/z 値を扱っていました。通常、分析種の質量は、分子のノミナル質量と同一である分子イオンのノミナル質量（ノミナル m/z 値）として報告されていました。イオン、分子、ラジカルのノミナル質量は、元素組成中の元素のノミナル質量の合計です。元素のノミナル質量は、天然に存在する存在量が最も多い安定同位体の整数質量です。
しかし、1990 年代前半以降、エレクトロスプレーイオン化（ESI）などのソフトイオン化脱離手法が幅広く製品化されるようになると、このような質問に回答しにくくなりました。MS に「脱離」が登場する前の時代には、MS で調べていたほとんどの分析種のノミナル質量は 500 Da 未満でした。水素の存在による質量欠損は、これらの分析種では問題にはなりませんでした。ほとんどの質量分析計の m/z の上限は 650 ～ 800 の範囲に収まっていました。したがって、脱離イオン化が登場する前は、ノミナル質量と整数モノアイソトピック質量は同じ値でした。イオン、分子、ラジカルのモノアイソトピック質量は、元素組成中の元素のモノアイソトピック質量の合計です。元素のモノアイソトピック質量は、天然に存在する存在量が最も多い安定同位体の精密質量です。
脱離イオン化時代の初期に、高分子および高精度が、テクノロジーの進歩により実現可能になったため、それらが研究に不可欠になりました。そのとき初めて質量欠損の問題が非常に重要になりました。最も近い整数の m/z 値のみを報告できる質量分析計では、C50H102 化合物の分子イオンは、m/z 703 のピーク（m/z 702 ではなく）として表されます。これは、分子イオンのモノアイソトピック質量が 702.7825 で、四捨五入して整数値にすると 703 になるためです。
500 Da 超では、質量欠損が MS ピークの m/z 値を決定する上で重大な問題になります。質量分析計では、使用する m/z アナライザーの種類とは関係なく、マススペクトルの収集の間の特定の時間に生じるシグナルの強度を測定していることに留意が必要です。報告される m/z 値は、特定の化合物から生じる既知の m/z 値のイオンが検出器に到達する時間の、キャリブレーション化合物の場合の時間に対する関数です。
m/z スケールでの位置が変わると、モノアイソトピック質量が変わるため、整数の m/z 値が報告される質量分析計では、実際は測定を m/z 0.05 単位で行うことができます。検出強度は、マススペクトルのピーク頂点での強度である場合もあれば、マススペクトルのピーク全体の強度の合計である場合もあります。報告される m/z 値は、マススペクトルピークの最大値で観察される m/z 値を四捨五入して得られる整数です。
電子衝突イオン化 MS は、多くの場合 m/z スケールのキャリブレーションに使用するパーフルオロトリブチルアミン（ノミナル分子質量 671）などのペルフルオロ化合物に頼っています。これは、イオンの整数質量がモノアイソトピック質量とほぼ同一であるためです。イオンがノミナル質量 1000 Da を超えると、マススペクトルにノミナル m/z 値ピークは観察されません。モノアイソトピック質量のピークでは、イオンの質量欠損に等しい量が、ノミナル質量のピークが観察されるはずの位置からオフセットされます。質量が 500 Da を超える一価イオンでは、m/z スケール全体にわたって単位分解能のある透過型四重極を備えたエレクトロスプレーや四重極イオントラップ質量分析計などの手法を使用すると、同位体ピークが明確に分離されます。
化合物の同定において同位体の果たす役割については多くの議論がなされていますが、LC-GC ヨーロッパで発表された論文は、バランスを取るのに役立ちます。「Interpretation of Isotope Peaks in Small Molecule LC–MS（低分子 LC-MS での同位体ピークの解釈）」（L.M. Hill, LCGC Europe 19(4), 226–238 (2006)）は、低分解能イオントラップ動作に基づいています。関連する部分で、著者は、イオントラップを使用する際に過信しないよう以下のように注意を喚起しています。「イオントラップのユーザーは、QTOF やトリプル四重極システムのユーザーよりも慎重になる必要がある。汚染されていない孤立した +1 の同位体ピークから開始することが明らかに必要である . . .イオントラップでは、スキャンよりも低分解能でトラップし、 . . .質量の順にトラップが . . .空になる可能性がある。」これは、イオントラップが使用できないという意味ではありませんが、すべての装置と同じく、その能力と限界を良く理解した上で適用する必要があります。
同様に、非常に高い分解能を有する装置でも、自動的に正しい回答が得られるとは限りません。Kind および Fiehn が発表した論文（T. Kind and O. Fiehn, BMC Bioinformatics 7, 234 (2006)）は特に衝撃的で、160 万もの化学式を検索した結果に基づき、「高質量精度（1 ppm）および高分解能のみでは不十分である。同位体存在量のパターンフィルターによってのみ、候補となる分子式の数を減らすことができる。」と結論しています。質量精度がわずか 3 ppm でも、同位体パターン精度が 2% の質量分析計では通常、偽候補の 95% 超が除かれます。このような装置は（もし実際に存在すれば）、0.1 ppm の性能を有して同位体パターン機能を搭載していない質量分析計よりも勝ることになります。
150 Da ～ 900 Da の範囲の質量では、質量精度が 10 ppm から 0.1 ppm に上がると、同位体存在量情報の支援なしでリストに上がる化学式の数が増加しました。10 ppm では、低い方の 150 Da では候補化学式 2 つから 900 Da では候補化学式が 3447 になりました。上限（900 Da）でも、質量精度 1 ppm のみで 345 の候補が得られました。同位体存在量精度 2% で呼び出したところ、900 Da の候補数は 18 に減少しました。また、5 ppm の精度に関連する同位体取り込みにおいて、わずか 5% の精度にしたところ、候補が 196 になりました。
