Guia abrangente para hidrólise e análise de aminoácidos

A tarefa de separar, identificar e quantificar com exatidão os aminoácidos na pesquisa, no desenvolvimento e na comercialização de alimentos, rações e produtos bioterapêuticos é um desafio. Comum a essas aplicações é a necessidade de hidrólise adequada de amostras, uma primeira etapa importante na rotina de trabalho para análise de aminoácidos ligados, como peptídeos e proteínas. A hidrólise permite a análise dos aminoácidos liberados, que podem ser separados por meio de métodos cromatográficos de troca iônica ou de fase reversa.

Considerando os desafios da rotina de trabalho de preparo de amostras, este documento foi compilado para fornecer diretrizes úteis para a hidrólise de amostras. O material contido neste documento serve apenas como ponto de partida para esse processo. Dependendo do tipo de amostra e de sua complexidade, podem ser necessárias modificações nos métodos de hidrólise descritos. Para obter informações adicionais ou dicas de solução de problemas sobre hidrólise ou um procedimento específico, entre em contato com o fabricante do seu equipamento de hidrólise ou com a agência apropriada – Associação de Químicos Analíticos Oficiais (AOAC, Association of Official Analytical Chemists). A Waters não pode fornecer orientação sobre tipos específicos de amostras.

Para analisar as amostras hidrolisadas (aminoácidos liberados) por HPLC ou UPLC, a Waters fornece muitas soluções que utilizam derivatização pré-coluna para que os aminoácidos possam ser analisados por detecção óptica. Como essa é uma parte integrante da rotina de trabalho, incluímos breves introduções ao Método Waters HPLC (AccQ•Tag) e à Solução para análise de aminoácidos UPLC (AccQ•Tag Ultra). Este documento não contém informações relacionadas ao método de análise de aminoácidos Waters Pico-Tag (reagente de derivatização pré-coluna de fenil isotiocianato). Embora o método Pico-Tag ainda esteja disponível, os métodos baseados no AccQ•Tag oferecem benefícios significativos de desempenho e são recomendados para novas aplicações.

Observação: Este documento é dedicado à hidrólise e à análise de aminoácidos de proteínas/peptídeos purificados, alimentos e rações. Não se destina a abordar especificamente a análise de aminoácidos em amostras de urina, plasma, produtos de nutrição parenteral total ou meios de cultura de células. Para obter informações sobre essas aplicações, acesse www.waters.com/AAA e www.waters.com/Kairos.

Diretrizes e recomendações gerais de análise

Dada a natureza ubíqua dos aminoácidos no ambiente, a contaminação de fundo pode contribuir facilmente com 20 pmol ou mais de alguns aminoácidos para a análise de amostras desejada, particularmente para serina (Ser) e glicina (Gly). A quantidade pode ser reduzida exercendo precauções especiais. Alternativamente, se uma amostra suficiente for hidrolisada para fornecer um mínimo de 200 pmol por aminoácido, a contribuição da contaminação de fundo pode ser limitada a menos de 10%. Independentemente disso, para aproveitar a sensibilidade das técnicas modernas de derivatização e dos sistemas cromatográficos, que podem ter limites de detecção de 1 pmol ou menos, limpeza e boas técnicas de laboratório são essenciais. As fontes de contaminação estão por toda parte; Vidraria suja, animais de laboratório, poeira transportada pelo ar, impressões digitais e pó de talco são agressores comuns.

Embora não haja um sistema único e perfeito para melhorar a qualidade geral das análises de aminoácidos de baixo nível, as seguintes considerações e práticas ajudam:

• Pirolisar todos os tubos de hidrólise de 6 x 50 mm (PN: WAT007571) durante a noite a 500 °C para fornecer o vidro mais limpo possível. Depois de remover os tubos do forno resfriado, cubra-os com folha de alumínio (limpa com acetona) e armazene-os em uma área coberta.
• Fique atento à possível introdução de contaminantes de pipetas, ponteiras descartáveis, seringas e outros acessórios utilizados no procedimento.
• Antes da hidrólise, execute todas as etapas de manuseio com luvas limpas e sem pó e uma pinça limpa. A utilização de máscaras cirúrgicas pode ser apropriada.
• Sempre utilize reagentes novos. Cada reagente pode ser uma fonte de contaminação. A melhor prática é dividir os frascos recém-abertos em recipientes menores e limpos.
• Verifique a qualidade do reagente semanalmente com derivatizações em branco de controle.
• Sempre utilize o procedimento de hidrólise em fase de vapor, quando possível. O HCl impuro pode ser a fonte de hidrólise não confiável. Nossos resultados mais consistentes têm sido com HCl em ebulição constante. Provavelmente, o HCl concentrado de grau reagente de alta pureza não é tão limpo e contém níveis significativamente mais altos de cloro do que o grau de ebulição constante.
• Teste os constituintes da água e do tampão quanto a qualquer contribuição para a contaminação de fundo como amostras de controle. Por exemplo, a água bidestilada de laboratório muitas vezes contribui com níveis inaceitáveis de aminoácidos. Para obter a melhor qualidade de água, é altamente recomendável um sistema de purificação (água de 18,2 mΩ-cm).
• Um branco de controle adequado para hidrólise é um tubo de amostra que foi tratado exatamente como uma amostra é tratada. Isso inclui a etapa de hidrólise.