Guia abrangente para hidrólise e análise de aminoácidos

Alimentos e rações são feitos de compostos químicos que contêm aminoácidos essenciais para o crescimento e a nutrição. Analisar o conteúdo de aminoácidos é importante para garantir uma nutrição adequada. No entanto, esses produtos são produzidos em processos a granel. Tal como acontece com a produção farmacêutica, os processos a granel podem variar em seus resultados durante uma corrida de produção. Deve-se considerar o que constitui uma amostra representativa. Normalmente, é necessária uma estratégia de subamostragem. A análise de aminoácidos desses produtos requer várias abordagens para analisar adequadamente as amostras quanto à composição total de proteínas. Como alimentos e rações são produzidos a granel e contêm constituintes não proteicos, a hidrólise líquida é recomendada.

Observação: Os aminoácidos contendo enxofre, cisteína e metionina, e o aminoácido triptofano, não são estáveis na hidrólise ácida padrão. Metodologias alternativas podem ser empregadas para analisar esses aminoácidos de forma eficaz.

Nesta seção, apresentamos três procedimentos de hidrólise diferentes:

• Hidrólise ácida – para determinar a composição e o teor total de proteína
• Oxidação com ácido perfórmico – para medir os aminoácidos contendo enxofre, cisteína e metionina
• Hidrólise alcalina – para avaliar a recuperação de triptofano

Ao analisar os aminoácidos ligados às proteínas, as ligações peptídicas devem ser quebradas para liberar os aminoácidos para análise (Figura 1). Para amostras de proteínas de ração a serem hidrolisadas, o pH do material da amostra e a presença de sólidos devem ser considerados. Como mencionado nas seções anteriores, a taxa ou extensão da hidrólise varia entre os aminoácidos presentes nas proteínas. Isso se aplica em particular a proteínas ligadas em materiais alimentícios. Como em qualquer método de hidrólise, os parâmetros selecionados devem ser o resultado de uma experimentação cuidadosa.

Na análise de rações, três fatores de preparo de amostras devem ser considerados:

1. Processamento de amostras
2. Quantidade de amostra hidrolisada
3. Volume de ácido utilizado para hidrólise

3.2.1 Processamento de amostras

Normalmente, grãos de ração e amostras semelhantes não são uniformes. Para torná-los o mais uniformes possível, as amostras devem ser trituradas até formar um pó fino. Amostras com alto teor de gordura podem ser desengorduradas por procedimentos padrão antes da trituração final. Um pó fino permite a hidrólise eficaz das proteínas de ração. O Método da AOAC (4.1.11, 994.12b, J.AOAC Int. 88, 2005, Análise de aminoácidos de rações) exige que a amostra de teste seja triturada até que passe através de uma peneira de 0,25 mm ou de malha 60 (tamanho de partícula de 250 µm).

3.2.2 Quantidade de amostra

O método da AOAC para análise de aminoácidos de ração recomenda que o cálculo a seguir seja aplicado para determinar a quantidade de amostra utilizada em uma análise de ração.

Calcule a quantidade aproximada de porção de teste a ser utilizada da seguinte forma:

Ws = 1000/Ns

onde Ns = conteúdo de nitrogênio da porção de teste (%) e Ws = peso do material de teste equivalente a 10 mg de conteúdo de nitrogênio (mg).

Em geral, isso cairá no intervalo de 100–1000 mg do material para cada amostra analisada.

3.2.3 Volume de ácido

Como observado anteriormente, um grande excesso de peso de ácido é necessário para a hidrólise eficaz das amostras de proteína. Rações não são diferentes. No entanto, ao contrário do excesso de 100 vezes discutido na Seção 2.1.2, a razão de peso de ácido adicionado ao peso da amostra varia de 50 a 500 vezes no Método 994.12 da AOAC. Esse intervalo e a presença de materiais particulados não proteicos a granel nas rações apontam para a necessidade de um estudo cuidadoso de verificação do intervalo antes da utilização de rotina para análise de rações.

3.2.4 Padrões internos

A utilização de um padrão interno (IS, Internal Standard) compensa melhor a hidrólise variável dos aminoácidos individuais da amostra. A Waters recomenda a utilização de norvalina (Nva) como IS para AccQ•Tag Ultra no UPLC e ácido alfa-aminobutírico (AABA, Alpha-Aminobutyric Acid) ou norleucina para AccQ•Tag no HPLC. O padrão interno recomendado no Método AOAC 994.12 para análise de rações é a norleucina. Deve-se ter cuidado ao escolher um IS para garantir que as resoluções desejadas possam ser alcançadas entre os picos de aminoácidos na cromatografia.

3.2.5 Método 994.12 AOAC “Aminoácidos em rações”

A literatura contém uma variedade de métodos que podem ser adaptados para a análise de aminoácidos em rações. O método apresentado aqui foi adaptado do Método AOAC 994.12 “Aminoácidos em rações”.

• Balança analítica, legibilidade ± 0,1 mg
• Balança, carregamento superior
• Frasco, 50 mL; polietileno
• Tubos de digestão, frascos de ebulição são adequados
• Bloco de digestão, manta aquecedora ou banho-maria são adequados
• Unidades de filtro, 0,22 µm (Millex GS, Millipore são adequadas)
• Medidor de pH, calibrado com tampões de pH 2,0, 4,0 e 7,0
• Condensador de refluxo
• Evaporador rotativo
• Béqueres de vidro de 250 e 1000 mL
• Balão de Erlenmeyer, 150 mL
• Balão de evaporação de fundo redondo, 1000 mL
• Provetas graduadas, 100, 500 e 1000 mL
• Balão volumétrico, 1000 mL
• Pipetas volumétricas, 10 e 20 mL
• Filtro de vidro sinterizado, porosidade de 10–15 µm
• Seringas

• Cristais de DL-norleucina
• Ácido clorídrico, concentrado
• Solução de hidróxido de sódio 30% (30 g/100 mL)
• Cristais de fenol
• Solução de tiodiglicol 98%
• Citrato trissódico dihidratado
• Tampões de pH, pH 2,0, 4,0 e 7,0

Tampão de citrato de sódio — pH 2,20

1. Pese 19,60 g de citrato trissódico e hidrate em um béquer de 1000 mL.
2. Dissolva em aproximadamente 800 mL de H₂O.
3. Enquanto agita, adicione 10 mL de solução de tiodiglicol 98% e 15 mL de HCl.
4. Transfira a solução quantitativamente para um balão volumétrico de 1000 mL e dilua para marcar com H₂O.
5. Filtre a solução tampão através de um filtro de vidro sinterizado.
6. Ajuste o pH para 2,20 com HCl ou NaOH 2 M.

Solução de HCl-fenol 6 M.

1. Pese 1 g de cristais de fenol em um béquer de 1000 mL tarado.
2. Dissolva os cristais em 500 mL de H₂O. Enquanto agita, adicione lentamente 500 mL de HCl.

Solução de ácido clorídrico – 1 M

1. Despeje aproximadamente 800 mL de H₂O em um balão volumétrico de 1000 mL.
2. Com uma pipeta, adicione 83,3 mL de HCl.
3. Dilua até a marca com H₂O e misture cuidadosamente.

Solução de ácido clorídrico – 0,1 M

1. Despeje aproximadamente 800 mL de H₂O em um balão volumétrico de 1000 mL.
2. Com uma pipeta, adicione 100 mL de HCl 1 M.
3. Dilua até a marca com H₂O e misture cuidadosamente.

Solução de hidróxido de sódio (NaOH 2 M)

1. Pese 80,0 g de NaOH em um béquer de 1000 mL tarado.
2. Dissolva lentamente os pellets em um béquer em aproximadamente 600 mL de H₂O.
3. Resfrie a solução e transfira quantitativamente para um balão volumétrico de 1000 mL.
4. Dilua para marcar com H₂O e misture bem.

Solução de padrão interno

1. Pese precisamente 195–200 mg de cristais de DL-norleucina em um balão de Erlenmeyer de 150 mL tarado.
2. Dissolva com 100 mL de HCl 1 M.
3. Transfira a solução quantitativamente para um balão volumétrico de 1000 mL e dilua para marcar com H₂O.

1. Pese precisamente 100–1000 mg de amostra de teste finamente triturada para o 0,1 mg mais próximo (equivalente a aproximadamente 10 mg de teor de nitrogênio) em tubos de digestão rotulados. Utilize o cálculo descrito na seção acima para determinar a quantidade real de amostra a ser utilizada.
2. Adicione 50 mL de solução de HCl-fenol 6 M à porção pesada e agite brevemente. Adicione 2 ou 3 pedras de ebulição à solução.
3. Em uma capela de exaustão, hidrolise sob refluxo por 24 horas a 110-120 °C utilizando um bloco de aquecimento ou banho-maria equilibrado com a temperatura.
4. Remova os tubos de digestão do fogo e resfrie-os até a temperatura ambiente.
5. Adicione 20 mL de solução de padrão interno de norleucina a cada solução de teste utilizando uma pipeta volumétrica. Misture as soluções mexendo os balões.
6. Filtre os hidrolisados através de um filtro de vidro sinterizado para balões de evaporação de fundo redondo de 1000 mL.
7. Conecte os balões aos evaporadores rotativos e evapore a 60 °C até secarem.
8. Lave adicionando aproximadamente 20 mL de H₂O e repita a evaporação. Repita as etapas de lavagem e evaporação duas vezes.
9. Remova o frasco do evaporador.
10. Adicione 50 mL de tampão de citrato de sódio ao hidrolisado evaporado, misture bem e transfira para um frasco de polietileno de 50 mL rotulado.
11. A amostra está pronta para ser preparada para derivatização.

A cisteína e a metionina são aminoácidos essenciais na análise de materiais para rações; ambos são limitantes de crescimento para os animais que consomem a ração. Como as condições de hidrólise ácida padrão não funcionam para esses aminoácidos específicos, normalmente é realizada uma oxidação alternativa utilizando ácido perfórmico. Essa abordagem converte cisteína e cistina em ácido cianúrico, e metionina em metionina sulfona (Figura 3). As amostras podem então ser hidrolisadas com ácido e derivatizadas de forma eficaz.

Na literatura, existem várias versões de oxidação com ácido perfórmico. Embora os processos gerais sejam semelhantes, suas especificações diferem. Este guia apresenta dois procedimentos a serem utilizados como possíveis pontos de partida. O primeiro método é do AOAC 994.12. O segundo é um método alternativo baseado em MacDonald et al, 1985. Uma avaliação e otimização cuidadosas são necessárias antes de se comprometer com uma abordagem específica.

• Balança analítica, legibilidade ± 0,1 mg
• Balança, carregamento superior
• Frasco, 50 mL; polietileno
• Tubos de digestão, frascos de ebulição são adequados
• Bloco de digestão, manta aquecedora ou banho-maria são adequados
• Unidades de filtro, 0,22 µm (Millex GS, Millipore são adequadas)
• Medidor de pH, calibrado com tampões de pH 2,0, 4,0 e 7,0
• Condensador de refluxo
• Evaporador rotativo
• Béqueres de vidro de 250 e 1000 mL
• Balão de Erlenmeyer, 150 mL
• Balão de evaporação de fundo redondo, 1000 mL
• Provetas graduadas, 100, 500 e 1000 mL
• Balão volumétrico, 1000 mL
• Pipetas volumétricas, 10 e 20 mL
• Filtro de vidro sinterizado, porosidade de 10–15 µm
• Banho de gelo
• Seringas

• Ácido fórmico, 88%
• Peróxido de hidrogênio, 30%
• Metabissulfito de sódio
• Cristais de DL-norleucina
• Ácido clorídrico, concentrado
• Solução de hidróxido de sódio 30% (30 g/100 mL)
• Cristais de fenol
• Solução de tiodiglicol 98%
• Citrato trissódico dihidratado
• Tampão de pH, pH 2,0, 4,0 e 7,0

Tampão de citrato de sódio — pH 2,20

1. Pese 19,60 g de citrato trissódico e hidrate em um béquer de 1000 mL.
2. Dissolva em aproximadamente 800 mL de H₂O.
3. Enquanto agita, adicione 10 mL de solução de tiodiglicol 98% e 15 mL de HCl.
4. Transfira a solução quantitativamente para um balão volumétrico de 1000 mL e dilua para marcar com H₂O.
5. Filtre a solução tampão através de um filtro de vidro sinterizado.
6. Ajuste o pH para 2,20 com HCl ou NaOH 2 M.

Solução de HCl-fenol 6 M.

1. Pese 1 g de cristais de fenol em um béquer de 1000 mL tarado.
2. Dissolva os cristais em 500 mL de H₂O. Enquanto agita, adicione lentamente 500 mL de HCl.

Solução de ácido clorídrico – 1 M

1. Despeje aproximadamente 800 mL de H₂O em um balão volumétrico de 1000 mL.
2. Com uma pipeta, adicione 83,3 mL de HCl.
3. Dilua até a marca com H₂O e misture cuidadosamente.

Solução de ácido clorídrico – 0,1 M

1. Despeje aproximadamente 800 mL de H₂O em um balão volumétrico de 1000 mL.
2. Com uma pipeta, adicione 100 mL de HCl 1 M.
3. Dilua até a marca com H₂O e misture cuidadosamente.

Solução de hidróxido de sódio (NaOH 2 M)

1. Pese 80,0 g de NaOH em um béquer de 1000 mL tarado.
2. Dissolva lentamente os pellets no béquer em aproximadamente 600 mL de H₂O.
3. Resfrie a solução e transfira quantitativamente para um balão volumétrico de 1000 mL.
4. Dilua para marcar com H₂O e misture bem.

Solução de padrão interno

1. Pese precisamente 195–200 mg de cristais de DL-norleucina em um balão de Erlenmeyer de 150 mL tarado.
2. Dissolva com 100 mL de HCl 1 M. Transfira a solução quantitativamente para um balão volumétrico de 1000 mL e dilua para marcar com H₂O.

Reagente de ácido perfórmico

1. Prepare na capela. Pese 25 mg de cristais de fenol em um tubo de ensaio de 25 mL.
2. Com uma pipeta, adicione 0,5 mL de 30% H₂O₂.
3. Adicione 4,5 mL da solução de 88% ácido fórmico.
4. Cubra o tubo de ensaio com a rolha e deixe a mistura repousar por 30 minutos em temperatura ambiente.
5. Após 30 minutos, coloque os tubos de ensaio em um banho de gelo e resfrie a mistura de ácido perfórmico por 15 minutos.
6. Prepare o reagente imediatamente antes de utilizar.

1. Pese precisamente 100–1000 mg de amostra de teste finamente triturada para o 0,1 mg mais próximo (equivalente a cerca de 10 mg de teor de nitrogênio) em tubos de hidrólise rotulados. Utilize o cálculo descrito anteriormente para determinar a quantidade real de amostra a ser utilizada.
2. Coloque um agitador magnético em cada tubo e coloque os tubos de digestão em um banho de gelo (0 °C).
3. Depois que o ácido perfórmico e a porção de teste tiverem resfriado por pelo menos 15 minutos, adicione 5 mL de reagente de ácido perfórmico a cada tubo de digestão; tampe com uma rolha ou feche todos os tubos e mexa por 15 minutos.
4. Retorne os tubos de digestão para o banho de gelo e deixe as amostras oxidarem por 16 horas.
5. Remova as rolhas de vidro e adicione cerca de 0,84 g de metabissulfito de sódio para decompor o ácido perfórmico. Agite por 15 minutos para liberar SO₂.
6. A amostra agora está pronta para o estágio de hidrólise ácida.

1. Adicione 50 mL de solução de HCl-fenol 6 N à porção pesada e agite brevemente. Adicione 2 ou 3 pedras de ebulição à solução.
2. Em uma capela de exaustão, hidrolise sob refluxo por 24 horas a 110-120 °C utilizando um bloco de aquecimento ou banho-maria equilibrado com a temperatura.
3. Remova os tubos de digestão do fogo e resfrie-os até a temperatura ambiente.
4. Adicione 20 mL de solução de padrão interno de norleucina a cada solução de teste utilizando uma pipeta volumétrica. Misture as soluções mexendo os balões.
5. Prossiga com as etapas (a–d) ou (e–g) abaixo.
   1. Filtre os hidrolisados através de um filtro de vidro sinterizado para balões de evaporação de fundo redondo de 1000 mL.
   2. Conecte os frascos a evaporadores rotativos e evapore sob vácuo a 40 °C até aproximadamente 0,5 mL. Observação: Não deixe a solução evaporar até secar.
   3. Remova o frasco do evaporador.
   4. Adicione 50 mL de tampão de citrato de sódio ao hidrolisado evaporado, misture bem e transfira para um frasco de polietileno de 50 mL rotulado.
   5. Filtre os hidrolisados em um balão a vácuo de 250 mL através de um filtro de vidro sinterizado e, em seguida, transfira o filtrado para um béquer de 250 mL.
   6. Coloque o béquer no banho de gelo.
   7. Enquanto agita, neutralize parcialmente os hidrolisados com cerca de 40 mL de NaOH 7,5 M. (Observação: A temperatura não pode exceder 40 °C.) Ajuste o pH para 2,20 utilizando NaOH 2 M.

     6. A amostra está pronta para ser preparada para derivatização.

Observação: A literatura apresenta muitas referências diferentes para este ensaio. Não há um consenso sobre as quantidades de ácido perfórmico e brometo de hidrogênio ou a temperatura de evaporação. Alterar as quantidades e/ou temperatura afetará o tempo de evaporação na Etapa 7.

• Tubos de 25 x 150 mm com tampas
• Banho de gelo e gelo
• Pipetas volumétricas
• Evaporador a vácuo
• Fonte de nitrogênio limpa
• Forno ou bloco de aquecimento
• Vidraria volumétrica
• Ácido perfórmico
• Peróxido de hidrogênio
• Ácido fórmico
• Água ultrapura
• Solução de HBr, 48% em peso

1. Adicione um volume de peróxido de hidrogênio 30% a nove volumes de ácido fórmico 88%.
2. Deixe a mistura repousar por uma hora, mexendo-a frequentemente.
3. Coloque a mistura em um banho de gelo por 30 minutos e utilize-a imediatamente.

1. Pese as amostras correspondentes a aproximadamente 20 mg de proteína (para o mg mais próximo) em tubos de 25 x 150 mm.
2. Coloque as amostras em um banho de gelo por 30 minutos.
3. Adicione 10 mL de ácido perfórmico frio às amostras, mexa suavemente e tampe com uma tampa revestida com Teflon.
4. Armazene as amostras (ainda em bastante gelo) a 0 °C durante a noite (16 horas) em um refrigerador.
5. Após 16 horas, com as amostras ainda a 0 °C, adicione 3 gotas de octanol e, em seguida, 3 mL de HBr 48% resfriado, mexendo as amostras lentamente. Faça esta etapa em uma capela. Deixe as amostras em repouso a 0 °C por 30 minutos.
6. Evapore até secarem com um evaporador a vácuo a 37 °C. Isso levará de 1 a 2 horas.
7. Adicione 5 mL de HCl 6 N aos tubos. Purgue com nitrogênio por 30 segundos e tampe imediatamente.
8. Coloque as amostras em um forno a 110 °C por 24 horas.
9. Retire-os do forno e deixe esfriar.
10. Adicione 10 mL de padrão interno de trabalho, 5,0 µmol/mL, e misture cuidadosamente. Observação: A concentração real do padrão interno utilizada deve ser calculada para fornecer a mesma quantidade de injeção no equipamento.
11. Transfira quantitativamente as amostras para balões volumétricos de 250 mL, enxaguando os tubos de amostras com água de grau HPLC e enchendo os balões para marcar com as lavagens.
12. Filtre aproximadamente 1 mL de amostras da Etapa 12 através de um filtro de amostra de 0,45 µm. Se a derivatização não ocorrer imediatamente, armazene as amostras tampadas em um freezer. Observação: A centrifugação pode substituir essa etapa de filtragem. Centrifugue para produzir um sobrenadante transparente.

Sob as condições padrão de hidrólise ácida, o triptofano (Trp) é instável e não pode ser analisado de forma eficaz. A hidrólise básica é proposta como método alternativo para a liberação e análise desse aminoácido em rações. Esse método utiliza NaOH 4,2 M para hidrolisar a proteína. Uma vantagem desse método é que, após a conclusão, não há necessidade de uma etapa de derivatização. A análise instrumental utilizando detecção UV a 280 nm é tudo o que é necessário.

O procedimento apresentado aqui é adaptado do Método AOAC 988.15 “Triptofano em alimentos e ingredientes de alimentos e rações”.

• Frascos micro Kjeldahl modificados (disponíveis na Ace Glass, Inc.) - Frascos micro Kjeldahl de 25 mL com diâmetro interno de 12 mm e gargalo de 15 cm de comprimento. O gargalo se contrai para cerca de 6 mm de diâmetro interno, 5 cm acima do bulbo do frasco.
• Bomba de vácuo
• Equipamento de filtro de membrana e filtros de 0,45 µm
• Gelo seco
• Banho-maria
• Etanol para banho-maria
• Pipetas volumétricas e vidraria
• Medidor de pH

• Água, purificada pelo sistema Milli-Q (Millipore Corp.), ou equivalente
• NaOH 4,2 M
• 1-octanol
• Solução tampão de citrato de sódio com pH 4,25
• HCl
• Solução padrão de triptofano
  • Solução estoque – 1 mg/mL. Dissolva 250 mg de L-triptofano em 100 mL de H₂O com seis gotas de HCl. Dilua para 250 mL com H₂O.
  • Solução de trabalho I – 0,1 mg/mL. Dilua a solução estoque de 10 mL para 100 mL com H₂O.
  • Solução de trabalho II – 0,04 mg/mL. Dilua a solução estoque de 4 mL para 100 mL com H₂O.
  • Refrigere as soluções padrão quando não estiverem em utilização. Prepare novas soluções mensalmente.

1. Triture a amostra de laboratório em um moinho centrífugo equipado com uma tela de 1 mm; misture bem.
2. Pese uma porção de teste contendo 100 mg de proteína em um frasco de micro Kjeldahl modificado.
3. Para amostras de teste com > 5% de lipídios:
   1. Adicione 10 mL de éter de petróleo à porção de teste pesada no balão.
   2. Mexa suavemente e aplique sonicação por 20 minutos. Deixe assentar. Centrifugue se necessário.
   3. Retire o máximo possível de éter de petróleo, tomando cuidado para não remover sólidos.
   4. Evapore o éter de petróleo restante sob um fluxo suave de N₂. Passe para a hidrólise.
4. Para amostras de teste com < 5% de lipídios: passe para a hidrólise.

1. Retire o ar do NaOH 4,2 M borbulhando com N₂ por 10 minutos.
2. Adicione 10 mL de NaOH 4,2 M sem ar a cada balão.
3. Adicione três gotas de 1-octanol.
4. Congele imediatamente a solução tratada em um banho de gelo seco/álcool etílico. Em seguida, remova o balão do banho e evacue-o para 10 mm.
5. Desligue o vácuo e vede os balões.
6. Coloque o balão vedado em um béquer contendo H₂O em temperatura ambiente até que a solução de teste derreta.
7. Coloque o balão em um forno a 110 °C por 20 horas.
8. Deixe os balões esfriarem até a temperatura ambiente.
9. Lave o gargalo do balão com 1 mL de solução tampão de citrato de sódio de pH 4,25, coletando o enxágue em um béquer.
10. Transfira quantitativamente o hidrolisado para o mesmo béquer de 50 mL, enxaguando o balão com duas porções de solução tampão de citrato de sódio com pH 4,25.
11. Neutralize a solução com 3,5 mL de HCl e agite vigorosamente. Ajuste o pH para 4,25 ± 0,05.
12. Transfira quantitativamente a solução para um balão volumétrico de 25 mL e dilua para o volume com H₂O.
13. Despeje a solução em um tubo de centrífuga de 40 mL e centrifugue por 20 minutos a 1150 G.
14. Filtre o sobrenadante através de um papel de filtro de vidro (Whatman GF/A).
15. Transfira o filtrado para um tubo de centrífuga e centrifugue por 10 minutos a 23000 G.

Observação: Neste ponto, é possível retirar uma alíquota do sobrenadante para análise UV (289 nm), sem derivatização.