Guia abrangente para hidrólise e análise de aminoácidos

A análise de aminoácidos por cromatografia líquida e detecção óptica requer preparo adicional da amostra, porque a maioria dos aminoácidos não tem um cromóforo e não pode ser detectada. Assim, após a hidrólise, a próxima etapa em uma análise de aminoácidos é a derivatização. Esta seção descreve o preparo de hidrolisados de proteínas ou peptídeos para derivatização utilizando as químicas Waters AccQ•Tag.

Para derivatizar de forma adequada e confiável uma amostra hidrolisada, o seguinte deve ser considerado:

• Remoção de partículas
• Determinação da massa da amostra para derivatização
• Determinação se a neutralização da amostra é necessária
• Uso de excesso de reagente de derivatização com base na massa da amostra

As discussões a seguir precisaram ser resumidas. Para obter informações adicionais e orientação sobre as químicas de derivatização AccQ•Tag, acesse www.waters.com/AAA.

A centrifugação pode ser necessária se grandes quantidades de partículas ou lipídios flutuantes estiverem presentes. A centrifugação facilita a retirada de uma alíquota de hidrolisado transparente para derivatização.

Para amostras de grande volume, como hidrolisados de análise de ração, a filtração das partículas pode ser suficiente, observando que as recuperações de amostra podem ser afetadas pela escolha do material de filtro. Esse fator precisa ser considerado e tratado para obter resultados não tendenciosos. Entre em contato com o fabricante do filtro para obter detalhes sobre o desempenho do filtro nessa aplicação.

O Método AccQ•Tag é uma técnica de derivatização pré-coluna para análise de aminoácidos de proteínas e peptídeos hidrolisados. O Método AccQ•Tag realiza o seguinte:

• Utiliza o Reagente Waters AccQ•Tag Ultra ou AccQ•Fluor para derivatizar os aminoácidos
• Separa os derivados utilizando HPLC ou UPLC de fase reversa, com base em gradiente
• Quantifica com exatidão os derivados utilizando padrões de aminoácidos externos e detecção óptica

O reagente de 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamato (AQC, Aminoquinolyl-N-Hydroxysuccinimidyl Carbamate) reage com aminas primárias e secundárias. O excesso de reagente AQC reage com água para formar 6-aminoquinolina (AMQ, Aminoquinoline). A AMQ reage lentamente com o excesso de reagente AQC para formar uma bis ureia. Esses produtos secundários não interferem na separação, identificação e quantificação dos aminoácidos contidos no peptídeo ou nos hidrolisados de proteína. Os derivados ficam estáveis por dias, permitindo o processamento em lote ou a repetição da análise, se desejado.

Ao longo de muitos anos, estudos extensivos foram realizados para garantir a exatidão da reação de derivatização do AccQ•Tag. A própria reação química requer um excesso molar do reagente de derivatização e pH básico (8–10) para a derivatização completa de todos os aminoácidos. Estratégias foram desenvolvidas para lidar com esses fatores críticos.

Na própria reação, a amostra é normalmente diluída 10x, e 1 µL de um volume total de derivatização de 100 µL é injetado na coluna. Como nem todos os aminoácidos estão presentes na mesma quantidade em uma derivatização, a quantidade de amostra deve ser suficiente para que o aminoácido menos abundante afete o limite de detecção ou quantificação. A derivatização de pelo menos 1 pmol do aminoácido menos abundante, em um volume máximo de injeção de 1 µL, é recomendada para obter uma quantificação exata. Para determinar a quantidade de amostra necessária, faça o seguinte cálculo:

Exemplo de cálculo:
Para uma concentração de amostra de 1,0 mg/mL de proteína:
Estime a quantidade de amostra necessária para o aminoácido menos abundante. Neste exemplo, presumimos que é necessário 0,03 mg/mL para fornecer 1 pmol desse aminoácido na coluna.

Converta mg em moles (o peso molecular médio de um resíduo de aminoácido em uma proteína é 110).

Esta é a concentração estimada do aminoácido menos abundante nesta amostra.

Isso resulta em uma diluição de 27 vezes (10 ÷ 0,37 = 27).

O hidrolisado requer uma diluição de 27 vezes antes da derivatização. Por exemplo: 5 µL do hidrolisado de amostra podem ser diluídos em 135 µL de HCl 0,1 N para produzir esse valor de destino.

Por fim, uma alíquota de 10 µL da diluição acima pode ser transferida para o vial de derivatização.

Para garantir a derivatização completa de reagente do AccQ•Tag dos aminoácidos contidos no hidrolisado, a amostra deve ser tamponada em um intervalo de pH aproximado de 8,2 a 10,1. Se o hidrolisado ácido não for devidamente neutralizado, e se o pH cair abaixo de 8,2, a derivatização será incompleta. O efeito do pH varia para cada aminoácido. Observe que nem todos os aminoácidos são afetados igualmente. Aminoácidos ácidos, como ácido glutâmico e alanina, são mais afetados do que a serina ou a fenilalanina. O pH é um fator crítico na obtenção da quantificação exata de todos os aminoácidos na amostra original.

• Se a solução de aminoácidos for dissolvida em HCl 0,1 N, 10–20 µL de amostra podem ser transferidos diretamente para o coquetel de derivatização sem ajuste de pH. Observação: Ainda é necessário garantir que o reagente de derivatização disponível tenha um excesso, conforme descrito abaixo.
• Se a solução de aminoácidos estiver em uma concentração maior de ácido (HCl > 0,1 N), ela deve ser neutralizada com um volume igual de hidróxido de sódio na mesma concentração. Isso pode ser feito como uma adição de volume em massa ou integrado na etapa de derivatização.
  • Substitua a quantidade necessária de tampão borato por NaOH para neutralizar o HCl na amostra.
  • Na mistura de vials de reação de derivatização, coloque 10 µL de xM NaOH e 60 µL de borato. Adicione 10 µL da amostra AA (em xN HCl). Derivatize com 20 µL de reagente AccQ•Fluor.
• Se houver dúvidas sobre a neutralização adequada, é possível preparar amostras de teste e verificar o pH final com tiras de pH de uso único.

ADVERTÊNCIA: Se a amostra ficar amarela brilhante após a adição do reagente de derivatização, isso indicará que o pH da amostra está muito baixo. Neutralize com NaOH.

Exemplo de cálculo:
Para determinar a quantidade de NaOH necessária para neutralização, realize o seguinte cálculo.
Para a amostra de proteína acima a 1,0 mg/mL em HCl 6 N, que precisa ser diluída 27x para garantir que haja excesso de reagente de derivatização na amostra, os cálculos a seguir se aplicam.

Converta a concentração de ácido da amostra de molar em µmoles:

Determine a concentração final de ácido na amostra diluída:

Lembrete: 5 µL do hidrolisado de amostra podem ser diluídos em 135 µL de HCl 0,1 N para produzir esse valor de destino.

A quantidade total de NaOH necessária por derivatização é de 0,31 M.

Como o tampão borato total adicionado à derivatização é de 70 µL, existem dois métodos para neutralização:

Adicione 10 µL de NaOH 0,31 M e 60 µL de tampão para cada derivatização.

Em um vial separado, misture 600 µL de tampão borato e 100 µL de NaOH 0,31 M. Misture. Adicione 70 µL dessa mistura + 10 µL de amostra + 20 µL de reagente de derivatização AccQ•Tag para cada amostra.

Para a derivatização completa de todos os aminoácidos, é necessário um excesso molar de 4 a 6x do reagente de derivatização do AccQ•Tag na reação. Se não houver reagente suficiente, alguns aminoácidos relativamente sensíveis não serão completamente derivatizados. As taxas de derivatização para cada aminoácido variam com base nas propriedades químicas dos aminoácidos; por exemplo, a recuperação de alanina pode ser significativamente afetada por excesso molar insuficiente de AccQ•Tag, enquanto a fenilalanina é mais imune a esses efeitos.

Para determinar a quantidade de amostra a ser adicionada ao vial de reagente, precisamos saber a quantidade de reagente em cada vial. O vial de reagente do AccQ•Tag padrão contém 3–4 mg de reagente, o que corresponde a aproximadamente 10–14 µmoles de reagente. Como o reagente é dissolvido em 1 mL de acetonitrila e são utilizados 20 µL para cada reação de derivatização de 100 µL, cada recipiente de reação contém 210–280 nmoles de reagente de derivatização.

Como cada vial de reação contém 210–280 nmol de reagente e precisamos de excesso molar de 4–6x para cada amostra, não deve haver menos de 40–140 nmoles de aminas totais em cada reação.

Exemplo de cálculo:
Para uma amostra de proteína, utilize o peso da amostra e o peso médio de um aminoácido para estimar o excesso necessário.

Por exemplo, com uma concentração de proteína de 1 mg/mL e um peso molecular médio de 110, a quantidade de proteína na amostra é determinada da seguinte forma:

onde MW é convertido em unidades de g/mol para µg/µmol, e

    1 mL = 103 µL

    1 mmol = 103 µmol = 106 nmol

Uma vez que a concentração molar é determinada, a quantidade de aminoácidos na amostra é calculada.

Utilizando a proteína de 1 mg/mL na Etapa 1, que exigia uma diluição de 27x (estoque de 5 µL de hidrolisado + 135 µL de tampão) da Seção 6.3.1, o nmol em 10 µL da amostra diluída é calculado da seguinte forma:

3,3 nmol está bem abaixo do limite de 140 nmol, então a amostra é aceitável.

O Método AccQ•Tag para HPLC, comercializado pela Waters Corporation em 1992, utiliza a mesma etapa de derivatização pré-coluna que o Método AccQ•Tag Ultra que foi introduzido em 2006. O reagente AccQ•Fluor, 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamato (ACQ), derivatiza aminas primárias e secundárias em uma reação simples de etapa única para produzir adutos fluorescentes altamente estáveis. Oferecemos o Método AccQ•Tag como um pacote do sistema que inclui reagentes pré-embalados e uma extensa documentação. O pacote de químicas AccQ•Tag contém os itens necessários para até 250 análises de aminoácidos hidrolisados de proteínas e peptídeos.

O Kit de derivatização AccQ•Tag contém cinco conjuntos de reagentes de derivatização. Cada conjunto de reagentes inclui um vial cada dos seguintes componentes:

• Tampão borato AccQ•Fluor – adicionado às amostras para garantir o pH ideal para derivatização.
• Pó de reagente AccQ•Fluor – 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamato. Reagente de derivatização (ACQ) (enviado seco para máxima estabilidade).
• Diluente de reagente AccQ•Fluor – acetonitrila, é utilizado para reconstituir o reagente para derivatização.

A Solução para análise de aminoácidos UPLC da Waters foi desenvolvida de forma holística para análises de aminoácidos prontas para uso. Os aminoácidos derivatizados pré-coluna são analisados em um Sistema Waters ACQUITY UPLC utilizando a coluna de UPLC de fase reversa, eluentes e métodos AccQ•Tag Ultra incluídos. A química de derivatização robusta, as linhas de base cromatográficas estáveis e a resolução superior de aminoácidos ajudam a garantir resultados quantitativos exatos, precisos e consistentes.

A Solução para análise de aminoácidos UPLC inclui:

• Suprimentos de químicas Waters AccQ•Tag Ultra, incluindo coluna, reagentes e eluentes – todos testados pelo controle de qualidade com o aplicativo de análise de aminoácidos
• O software Empower 2, projetos, métodos e formatos de relatório pré-configurados
• Documentação completa de apoio em nível de aplicação e de sistema

O Sistema Waters ACQUITY UPLC é compatível com três detectores ópticos diferentes: UV ajustável, PDA e detector de fluorescência.

A Solução para análise de aminoácidos UPLC inclui dois métodos completos que utilizam os mesmos equipamentos e químicas. O primeiro é adequado para os aminoácidos derivados de hidrolisados de proteína. O segundo é adequado para o maior número de aminoácidos livres encontrados em amostras de processo, como cultura de células ou caldos de fermentação. Os métodos diferem na diluição do Eluente A AccQ•Tag Ultra e na temperatura da coluna de separação. Não há ajustes de pH ou modificações de composição pelo usuário para o Eluente A ou o Eluente B.

A análise de aminoácidos de proteínas é utilizada como parte de uma determinação estrutural e como uma medida da quantidade total de proteína em uma amostra. A amostra é hidrolisada antes da análise. Para análises estruturais, as razões molares observadas dos aminoácidos são comparadas com os valores esperados da sequência.

Para quantidades de proteína, os pesos dos aminoácidos são somados. Esta medida de concentração de proteína é utilizada para calcular coeficientes de extinção em que a composição da amostra interfere em ensaios de proteína comuns. Tanto o percentual de peso de cada aminoácido quanto a massa total de proteína são utilizados para avaliar o conteúdo nutricional de alimentos e rações. A Solução para análise de aminoácidos UPLC da Waters fornece análises robustas e de rotina em todas essas aplicações.