Guia abrangente para hidrólise e análise de aminoácidos

Como observado anteriormente, existem vários equipamentos destinados especificamente para auxiliar na hidrólise de amostras. Independentemente dos equipamentos, normalmente existem três protocolos de hidrólise diferentes: hidrólise ácida, utilizada para determinar a composição de proteína total; hidrólise ácida após a oxidação com ácido perfórmico, necessária para medir aminoácidos contendo enxofre, como cisteína e metionina; e hidrólise alcalina, utilizada para avaliar a recuperação de triptofano. Embora os equipamentos tradicionais para hidrólise de amostras frequentemente envolvam um processo demorado, os equipamentos para hidrólise por micro-ondas podem acelerar significativamente os processos. A implementação da hidrólise por micro-ondas para todos os três protocolos resulta em melhor controle das condições de hidrólise com melhor exatidão, reprodutibilidade, velocidade e robustez.

Utilizando a tecnologia de micro-ondas, o Sistema de reações por micro-ondas CEM Discover SP (CEM Corporation 3100 Smith Farm Road Matthews, NC 28104) (Figura 7) pode hidrolisar proteínas e peptídeos em preparo para análise de aminoácidos em apenas 15 minutos. Conforme ilustrado na Figura 8, a aplicação direta de energia de micro-ondas e a utilização de sensores de temperatura infravermelhos integrados permitem um rápido aquecimento e manutenção da temperatura definida para cada amostra. A agitação in situ garante uma distribuição uniforme de calor através da amostra, e a têmpera pós-reação resfria a amostra em segundos.

A seção a seguir descreve a configuração e a operação do sistema. Para obter mais informações, entre em contato com a CEM Corporation ou consulte o manual do sistema.

• O sistema tem um requisito elétrico de 110–140 VCA, 60 Hz, 10 A a 120 VCA.
• O sistema requer ventilação.
• O sistema requer um mínimo de 25 psi e um máximo de 60 psi de ar comprimido ou nitrogênio comprimido.
• O sistema requer um laptop (fornecido pela CEM) localizado a 3,04 m (10 ft) do sistema.

• HCl 6 N para hidrólise ácida, HCl concentrado:água destilada na proporção de 1:1.
• NaOH 4 N para hidrólise básica, dissolva 16 g de NaOH sólido em 100 mL de água destilada.
• Ácido perfórmico (somente pré-oxidação), ácido fórmico:peróxido de hidrogênio 30% na proporção de 9:1.
• Vial de 10 ou 35 mL para o Discover SP com barra de agitação e tampa.
• Cristais de fenol.

Opção 1

1. Pese 50–500 mg de amostra em um vial de 35 mL com barra de agitação.
2. Coloque os tubos de digestão em um banho de gelo por cerca de 15 minutos.
3. Após o resfriamento, adicione 5 mL de ácido perfórmico.
4. Cubra os tubos com rolhas de vidro e mexa em uma placa de agitação magnética em baixa velocidade por 15 minutos.
5. Retorne os tubos de digestão para o banho de gelo e deixe oxidar por 16 horas.
6. Remova as rolhas de vidro e adicione 0,84 g de metabissulfito de sódio para decompor o ácido perfórmico.
7. Realize a hidrólise ácida começando na Etapa 2 da Opção 1 na seção 5.4.2 Hidrólise ácida.

Opção 2

1. Pese 50–500 mg de amostra em um vial de 35 mL com barra de agitação.
2. Adicione 6 mL de solução de ácido perfórmico preparada recentemente (ácido fórmico: peróxido de hidrogênio 30% na proporção de 9:1).
3. Incube a mistura da reação em banho-maria a 50 °C durante uma hora.
4. Evapore a solução de ácido perfórmico residual até a secura em um evaporador a 50 °C.
5. Realize a hidrólise ácida começando na Etapa 2 da Opção 1 na seção 5.4.2 Hidrólise ácida.

Opção 1: amostra de 50 a 300 mg

1. Pese a amostra em um vial de 35 mL com barra de agitação.
2. Adicione 3% em peso de fenol.
3. Adicione 5 mL de HCl 6 N.
4. Tampe o vial.
5. Utilizando o Dynamic Method Control (Controle de método dinâmico), programe um método com 300 W, retenção de 15 minutos, 195 °C e 300 psi. A agitação deve ser ajustada para alta.
6. Coloque o vial na cavidade do Discover e pressione a tecla Start (Iniciar) para iniciar o método.
7. A amostra deve aquecer até 195 °C, a não mais que 250 psi (± 10%).

Opção 2: amostra de 300–500 mg

1. Pese a amostra em um vial de 35 mL com barra de agitação.
2. Adicione 3% em peso de fenol.
3. Adicione 10 mL de HCl 6 N.
4. Tampe o vial.
5. Utilizando o Dynamic Method Control (Controle de método dinâmico), programe um método com 300 W, retenção de 15 minutos, 195 °C e 300 psi. A agitação deve ser ajustada para alta.
6. Coloque o vial na cavidade do Discover e pressione a tecla Start (Iniciar) para iniciar o método.
7. A amostra deve aquecer até 195 °C, a não mais que 250 psi (± 10%).

Opção 1: amostra de 50 a 300 mg

1. Pese a amostra em um vial de 35 mL com barra de agitação.
2. Adicione 5 mL de NaOH 4 N.
3. Tampe o vial.
4. Utilizando o Dynamic Method Control (Controle de método dinâmico), programe um método com 300 W, retenção de 15 minutos, 195 °C e 300 psi. A agitação deve ser ajustada para alta.
5. Coloque o vial na cavidade do Discover e pressione a tecla Start (Iniciar) para iniciar o método.
6. A amostra deve aquecer até 195 °C, a não mais que 250 psi (± 10%).

Opção 2: amostra de 300–500 mg

1. Pese a amostra em um vial de 35 mL com barra de agitação.
2. Adicione 10 mL de NaOH 4 N.
3. Tampe o vial.
4. Utilizando o Dynamic Method Control (Controle de método dinâmico), programe um método com 300 W, retenção de 15 minutos, 195 °C e 300 psi. A agitação deve ser ajustada para alta.
5. Coloque o vial na cavidade do Discover e pressione a tecla Start (Iniciar) para iniciar o método.
6. A amostra deve aquecer até 195 °C, a não mais que 250 psi (± 10%).

As configurações de temperatura, tempo e energia dependem dos tipos de amostras que estão sendo hidrolisadas. É importante manter o micro-ondas funcionando durante todo o procedimento. Isso pode exigir alguma experimentação por parte do usuário para otimizar melhor suas amostras utilizando essa técnica.

Recomenda-se a utilização do tamanho, volume e recipientes de amostra corretos nos procedimentos descritos anteriormente. Esses fatores são essenciais para o sucesso da hidrólise. Alguns componentes da amostra permanecerão na fase sólida após a hidrólise e normalmente ficam pretos durante o processo, conforme mostrado na Figura 9. Essa ocorrência é normal; os aminoácidos estarão em solução. Se tiver dúvidas relacionadas à utilização do equipamento CEM, entre em contato com a CEM Corporation pelo e-mail molecular.support@cem.com ou ligando para o telefone 1-704-821-7015 e solicitando suporte da Equipe de preparo de amostras moleculares da CEM.