Guia abrangente para hidrólise e análise de aminoácidos

Embora este guia geralmente se concentre nas etapas iniciais da análise de aminoácidos — enfatizando o preparo de amostras para hidrólise — esta seção apresenta uma breve discussão das abordagens de quantificação mais comuns utilizadas na análise de aminoácidos. Nestes exemplos, os resultados da análise de aminoácidos foram obtidos; a concentração da amostra original precisa ser calculada. Estes exemplos pressupõem que os Reagentes AccQ•Tag ou AccQ•Fluor foram utilizados para a derivatização.

Antes de prosseguir com a quantificação:

• Verifique se todos os picos estão identificados corretamente.
• Se os tempos de retenção não coincidirem, verifique os valores na tabela de calibração.
• Verifique a integração correta de todos os picos.

Para algumas análises, o objetivo é simplesmente determinar a concentração da amostra analisada. Esses resultados são geralmente expressos em concentrações molares, como µmol/L. Os resultados cromatográficos são normalmente fornecidos em picomoles. Para determinar a concentração, os picomoles de aminoácidos relatados pelo software cromatográfico são divididos pelo volume de injeção. Esse valor é então multiplicado pelo volume de diluente dividido pelo volume derivatizado. Para concluir o cálculo, multiplique pelo fator de diluição e converta as unidades em µmoles por litro.

Exemplo de cálculo:
Para determinar a concentração do aminoácido na amostra original, com base no valor relatado, usamos a seguinte equação:

Onde:

pmol AA = a quantidade relatada para aminoácidos na amostra Vi = volume de injeção em µL, normalmente 1 µL

Vd = volume derivatizado em µL, normalmente 10 µL

Vr = volume de diluente utilizado para reconstituir a amostra em µL Fator de dil. = fator de diluição

Exemplo:

Uma amostra inicial de 100 µL de amostra de proteína hidrolisada foi diluída na proporção de 1:1 com padrão interno. Uma alíquota de 10 µL foi derivatizada. O volume de injeção foi de 1 µL, e o valor relatado foi de 312,5 pmoles para asparagina (Asn).

A concentração de Asn em µmol/L seria:

A determinação da composição de aminoácidos de uma proteína hidrolisada envolve o cálculo das razões molares dos componentes dentro de uma amostra.

Cada proteína pura possui um número estequiométrico específico de resíduos para cada aminoácido que contém. Idealmente, os resultados de uma análise produzem razões molares que são inteiras. O grau em que os valores observados se aproximam desse ideal é uma função da pureza da proteína ou do peptídeo, da adequação das condições de hidrólise e da qualidade da análise de aminoácidos.

Exemplo 1 (conforme refletido na tabela abaixo):

1. Tabule os Picomoles Observados para cada aminoácido (obtido na análise).
2. Faça uma estimativa do número de resíduos (Composição estimada) para cada aminoácido por inspeção. Observação: Os resíduos observados são a concentração molar relativa de cada aminoácido. Divida todos os picomoles observados pelo aminoácido menos abundante e arredonde para o dígito mais próximo.
3. Some os picomoles e o número de resíduos para todos os aminoácidos.
4. Calcule a média de pmol/resíduo dividindo o Picomole Observado pela Soma pela Composição Estimada da Soma.
5. Divida cada Picomole Observado pelo valor de picomoles/resíduo para determinar a Composição Observada.

ADVERTÊNCIA: Para proteínas maiores, a estimativa do número de resíduos é mais difícil devido à maior precisão necessária.

ADVERTÊNCIA: A recuperação de alguns aminoácidos da hidrólise pode ser variável (Ser, Tor, Tyr e Met estão sujeitos à degradação; as ligações Val e Ile podem ser difíceis de clivar).

Observação: Para melhorar a quantificação nesses casos, recomenda-se a realização de um estudo de curso de tempo. Normalmente, as amostras são hidrolisadas por 24, 48 e 72 (ou 96) horas; os valores de aminoácidos instáveis são determinados por extrapolação de volta ao tempo zero, enquanto os valores para Ile e Val são retirados da hidrólise mais longa.

Exemplo 2:
Em alguns casos, como observado anteriormente, o cálculo da porcentagem molar (o número de resíduos de cada aminoácido por 100 resíduos de proteína) pode ser satisfatório. Isso é determinado da seguinte maneira:

Se uma estimativa do peso molecular da proteína estiver disponível, duas abordagens poderão ser utilizadas para calcular uma composição aproximada:

1. Estime o peso molecular da amostra (MW, Molecular Weight).
2. Some os rendimentos totais de aminoácidos em picomoles.
3. Divida o peso molecular por 110, o MW médio dos aminoácidos. Observação: Isso proporciona uma boa aproximação do comprimento total da cadeia ou do total de aminoácidos.
4. Divida o rendimento total pelo comprimento da cadeia (igual à quantidade molar de amostra injetada).
5. Para cada aminoácido, divida a quantidade pela quantidade molar injetada (igual ao número de resíduos por mol). Examine os desvios dos valores integrais.
6. Varie levemente o divisor (quantidade molar injetada) para cima ou para baixo para minimizar o desvio das quantidades integrais (obtido na Etapa 5). Essa etapa pode ser simplificada com um programa de planilha eletrônica ou um software de aminoácidos personalizado que encontre os desvios mínimos.
7. Lembre-se de que os valores para aminoácidos instáveis e formadores de ligações estáveis podem desviar-se significativamente das quantidades integrais devido à fraca recuperação da hidrólise.

Esse procedimento alternativo requer mais conhecimento sobre a amostra.

1. Escolha um aminoácido na análise que atenda aos dois seguintes critérios:
   • Fornece bons rendimentos após hidrólise e derivatização (por exemplo, Asp, Glu, His, Arg, Ala, Pro, Leu, Phe, Lys). Gly pode ser uma escolha ruim porque é um contaminante de fundo comum; e
   • Pode ter apenas alguns resíduos por mol de amostra (com base no peso molecular estimado da amostra e no rendimento de aminoácidos). Essas informações podem ser obtidas a partir de outros procedimentos, como a digestão do brometo de cianogênio, que cliva a cadeia polipeptídica intacta seletivamente na metionina.
2. Com base nessas informações, escolha um valor integral para esse aminoácido.
3. Divida o rendimento do aminoácido selecionado pelo valor integral escolhido para obter a quantidade molar estimada de amostra injetada.
4. Siga a Seção 7.3.2.1, Etapas 5 e 6.
5. Verifique os valores (um maior e um menor que o valor integral escolhido) para ver se são obtidos desvios menores dos números inteiros.

A concentração de peptídeo ou proteína na amostra original pode ser calculada a partir da soma dos produtos do número de picomoles de cada aminoácido multiplicado por seu peso molecular correspondente.

Utilizando o exemplo citado na tabela da Seção 7.3.1, o cálculo começa da seguinte forma:

Exemplo de cálculo:

Para Asp (asparagina) na amostra: 220 picomoles observados com um peso molecular para o aminoácido de 133,10 g/mol resulta o seguinte:

Esse mesmo cálculo é aplicado para cada aminoácido desejado. A tabela abaixo mostra os picogramas calculados para cada aminoácido, com a soma total dos picogramas de proteína injetada da amostra no canto inferior direito.

Na análise de alimentos e rações, os valores calculados acima mencionados também se aplicam. No entanto, a informação mais importante para a maioria das análises de rações é o conteúdo de aminoácidos específicos que limitam o crescimento, como a metionina e a cisteína. O valor de maior preocupação é a % de conteúdo de aminoácidos por peso na amostra.

Para calcular a % em peso de um aminoácido:

Exemplo de cálculo:

O valor relatado de Quantidade (pmol/µL) deve ser multiplicado pelo MW de resíduos (gm/mol) e quaisquer fatores de conversão.

A quantidade relatada em g/mol é então multiplicada por qualquer fator de diluição. O resultado é então dividido pelo peso da amostra e, em seguida, multiplicado por 100 para converter em um percentual.

Exemplo de cálculo:

Onde:

    Quantidade = quantidade de aminoácidos em g/mL

    Diluição = diluição da amostra

Peso da amostra = peso em mg

Este método requer a utilização de um padrão interno.

Exemplo de cálculo:

A área do pico para o padrão interno é multiplicada pelo peso do aminoácido em mg. Isso é então dividido pelo resultado da multiplicação da área do pico do aminoácido pelo peso do padrão interno.

Onde:

    RF_aa = fator de resposta para o aminoácido

    P_n = área do pico para o padrão interno

    P_aa = área do pico para o aminoácido na amostra

    W_aa = peso do aminoácido em mg

    W_n = peso do padrão interno em mg

O cálculo da % de conteúdo começa com a multiplicação da área do pico do aminoácido pelo fator de resposta calculado. Em seguida, isso é multiplicado pelo fator do padrão interno. Esse número é então dividido pelo multiplicando da área do pico do padrão interno e pelo peso da amostra analisada. Em seguida, isso é convertido em uma porcentagem.

Onde:

    P_aa = área do pico do aminoácido

    P_n = área do pico do padrão interno

    RF_aa = fator de resposta calculado

    IS = fator de padrão interno calculado

Exemplo:

Para um aminoácido em uma amostra de ração, os seguintes valores foram determinados:

    Peso do aminoácido (W_aa) = 0,5 mg

    Área do pico do aminoácido (P_aa) = 100.000

    Área do pico do padrão interno (P_n) = 110.000

    Peso do padrão interno (W_n) = 0,5 mg

    Peso da porção de teste (W_s) = 10 mg

0,5 mg x 2 x 10-2 = 0,05

O aminoácido de interesse está presente em um nível de 0,9% por peso da ração.