Guia abrangente para hidrólise e análise de aminoácidos

Peptídeos e proteínas consistem em muitos aminoácidos que são unidos por meio de ligações peptídicas. Essas biomoléculas, por sua vez, compõem muitas amostras diferentes, como bioterapêuticos, alimentos e rações. Para analisar os aminoácidos contidos nessas biomoléculas, é fundamental que as ligações sejam hidrolisadas para formar aminoácidos livres. No entanto, durante esse processo, as diferentes propriedades químicas das ligações de aminoácidos conjugadas podem afetar a eficiência da clivagem das ligações de aminoácidos e a recuperação dos aminoácidos individuais. Por exemplo, a recuperação dos aminoácidos durante a hidrólise pode ser afetada por reações químicas específicas, interferências de matriz de reagentes e a estabilidade dos próprios aminoácidos.

Dadas as grandes diferenças nas propriedades químicas e físicas das amostras e dos aminoácidos, diferentes procedimentos de hidrólise foram desenvolvidos ao longo dos anos. Os procedimentos variam de acordo com o tipo de reação (química ou enzimática), a natureza da reação química (ácida ou básica) e o estado físico da reação (líquido ou vapor). As diferenças podem afetar a recuperação de aminoácidos específicos — que podem ser destruídos por reagentes específicos — ou a eficiência e o tempo necessários para a hidrólise. Em alguns casos, vários procedimentos de hidrólise podem ser necessários para determinar o conteúdo total de aminoácidos de uma amostra. Os tipos comuns de reações de hidrólise química e os modos de hidrólise são descritos abaixo.

Observação: A hidrólise enzimática, um procedimento raramente utilizado, não é abordada neste documento.

Observe também que muitas reações de hidrólise química podem ser realizadas com diferentes tipos de equipamento. Historicamente, os procedimentos de hidrólise utilizavam uma fonte de calor sob vácuo para garantir a conclusão da reação, mas com equipamentos mais modernos, a hidrólise induzida por micro-ondas também se tornou amplamente utilizada. Os benefícios de cada método são diferentes e devem ser investigados antes da seleção do equipamento.

1.1.1 Hidrólise ácida

A hidrólise ácida é o método mais comum de hidrólise de uma amostra de proteína, e o método pode ser realizado em fase de vapor ou líquida. Embora uma variedade de ácidos possa ser utilizada para essa reação, o mais comum é o HCl 6 M. Como o HCl é evaporativo, ele também pode ser utilizado para recuperar o hidrolisado em quantidades menores de tampão, um recurso que é particularmente útil para pequenas quantidades de amostra. Além disso, a versatilidade do HCl permite que ele seja utilizado em hidrólise em fase líquida ou de vapor.

A reação de hidrólise ácida com HCl 6 M resulta na adição de água a cada ligação peptídica covalente, produzindo os aminoácidos individuais desejados (Figura 1). No entanto, nem todos os aminoácidos são totalmente recuperados sob hidrólise por HCl. Alguns aminoácidos são hidrolisados em suas formas de ácido, como a asparagina e a glutamina, que formam o ácido aspártico e o ácido glutâmico, respectivamente. Além disso, outros aminoácidos não podem ser medidos de forma confiável. Por exemplo, o triptofano é destruído durante a reação, enquanto os aminoácidos contendo enxofre (por exemplo, cisteína, metionina) não podem ser medidos de forma confiável devido à destruição parcial dos aminoácidos. Além disso, aminoácidos como tirosina, serina e treonina podem ter recuperações mais baixas devido à natureza da hidrólise ácida.

No entanto, alguns dos aminoácidos de enxofre (por exemplo, cisteína, metionina) poderão ser preservados na hidrólise ácida por HCl se um pré-tratamento for realizado. Para quantificar com precisão esses aminoácidos, a amostra pode ser oxidada ou alquilada antes da hidrólise ácida por HCl. Para a oxidação, normalmente com ácido perfórmico, os aminoácidos contendo enxofre são oxidados antes da hidrólise ácida por HCl. Isso resulta na quantificação exata desses aminoácidos em suas formas oxidadas. Alternativamente, a alquilação permite a preservação dos aminoácidos contendo enxofre (cisteína) para uma quantificação exata em suas formas alquiladas. Dois dos reagentes alquilantes mais comuns produzem cisteína em uma das duas formas, piridiletil cisteína ou carboximetil cisteína. Uma vantagem adicional desse processo de alquilação é que ele não afeta outros aminoácidos.

Por último, devido aos desafios de quantificar alguns aminoácidos por hidrólise de HCl, existem técnicas alternativas de hidrólise ácida que podem ser aplicadas para aminoácidos específicos. Uma técnica utiliza ácidos sulfônicos, como os ácidos metanossulfônicos (MSA) para quantificar o triptofano e a metionina (na forma de sulfóxido). Embora esse reagente não seja volátil, ele preserva o sulfóxido de triptofano e de metionina para quantificação.

1.1.2 Hidrólise alcalina

Enquanto a hidrólise ácida utilizando HCl é de longe a técnica mais comum para hidrolisar proteínas e peptídeos, a hidrólise alcalina ou básica é frequentemente utilizada para medir o triptofano. Como o triptofano é estável sob condições básicas, essa técnica fornece uma quantificação exata de triptofano e é amplamente utilizada para uma variedade de amostras, desde alimentos e rações a peptídeos e proteínas. A hidrólise alcalina normalmente utiliza NaOH ou KOH como reagente. No entanto, a hidrólise alcalina não pode substituir a hidrólise ácida para a quantificação de todos os aminoácidos. Sob condições alcalinas, arginina, cisteína, serina e treonina são destruídas e não podem ser quantificadas. Outros aminoácidos também são afetados; por isso, a hidrólise alcalina é normalmente utilizada apenas para triptofano.

As reações de hidrolisado são realizadas tanto na fase líquida quanto na fase de vapor. Independentemente do modo, os equipamentos projetados especificamente para hidrólise facilitam a reação. Historicamente, muitas reações de hidrólise ocorreram em altas temperaturas e sob vácuo durante um período de horas a dias, mas com o advento dos equipamentos de hidrólise por micro-ondas, o mesmo processo pode ocorrer em minutos a temperaturas mais baixas.

1.2.1 Hidrólise em fase líquida

Na hidrólise em fase líquida, a amostra e o HCl são adicionados diretamente ao tubo de hidrólise para a reação. Esse procedimento requer a adição da amostra, do padrão interno e do ácido diretamente ao tubo de hidrólise. O tubo é lavado com nitrogênio e, em seguida, vedado e aquecido pelo tempo necessário para completar a hidrólise. A hidrólise líquida pode levar de horas a dias para ser concluída. Esse procedimento é normalmente utilizado para amostras mais complexas.

1.2.2 Hidrólise em fase de vapor

Na hidrólise em fase de vapor, a amostra reage apenas com HCl na fase de vapor. O procedimento requer a colocação da amostra e do padrão interno (se utilizado) em tubos de hidrólise. A amostra é então seca, e cada tubo é colocado aberto em um recipiente de hidrólise. O ácido (HCl 6 M) é adicionado ao fundo de um recipiente contendo os tubos, e o recipiente é então vedado, evacuado e lavado com nitrogênio. O recipiente é aquecido pelo tempo necessário para completar a hidrólise. Esse modo reduz a contaminação de qualquer reagente impuro, como HCl. A hidrólise da fase de vapor normalmente ocorre em uma taxa mais rápida do que a hidrólise da fase líquida. Na hidrólise em fase de vapor, as amostras normalmente precisam ser de alta pureza.