Guia abrangente para hidrólise e análise de aminoácidos

Os termos "proteína e peptídeo" referem-se a uma amostra relativamente pura de um biorreator ou processo de purificação. Essas amostras incluem pouco ou nenhum material não proteico adicional. A geração de aminoácidos livres a partir de um peptídeo ou de uma proteína intacta é uma etapa crítica na produção de dados exatos e úteis da análise de aminoácidos. Para permitir essa geração, é necessário quebrar ou hidrolisar uma proteína/peptídeo em seus constituintes de aminoácidos individuais.

Nesta seção, são apresentados os procedimentos básicos para a hidrólise de peptídeos e proteínas em fase de vapor e em fase líquida, enfatizando as considerações preliminares necessárias para uma análise ideal.

Subseções adicionais abrangem procedimentos alternativos de hidrólise para a análise de amostras especiais contendo aminoácidos que não são compatíveis com técnicas padrão de hidrólise de ácidos (HCl): triptofano e cisteína/cistina.

Nesta seção, vamos nos concentrar na hidrólise ácida por HCl, que é o método mais comum utilizado no preparo de amostras de aminoácidos. No entanto, para que as amostras de proteína sejam totalmente hidrolisadas (por qualquer método), vários fatores devem ser considerados. Os tampões de neutralização, bem como quaisquer sólidos presentes, devem ser considerados nas estimativas de procedimento. Além disso, a taxa ou extensão da hidrólise varia entre os aminoácidos presentes nas proteínas, necessitando de estudos de curso de tempo do processo de hidrólise e da validação adequada dos métodos gerais. O manuseio adequado das amostras durante a hidrólise garante resultados de alta qualidade. As dificuldades mais comuns nesse tipo de análise geralmente resultam de uma técnica inadequada ou malfeita. Para uma hidrólise eficaz com este método, quatro perguntas devem ser respondidas primeiro:

1. A diluição da amostra é necessária?
2. Qual é o volume da amostra a ser dispensado nos tubos de hidrólise?
3. Qual é o volume específico de ácido a ser adicionado aos tubos (apenas hidrólise líquida)?
4. Qual é a quantidade de padrão interno, se utilizado durante este estágio?

As seções a seguir descrevem as determinações necessárias e fornecem exemplos de cálculos quando apropriado.

2.1.1 Considerações preliminares

A menos que a amostra seja limitada, deve haver entre 2 e 25 µg de proteína presente na hidrólise, para minimizar os efeitos da contaminação. Independentemente do modo de hidrólise, recomenda-se 20 µg.

• Não deve haver excesso de material sólido na amostra. Este material pode interferir na hidrólise da fase de vapor.
• Se outros sólidos estiverem presentes na amostra com a proteína, esses pesos devem ser adicionados à proteína na concentração de sólidos por volume de ácido.
• A concentração líquida de ácido na hidrólise deve ser de aproximadamente 6 N.
• A utilização de um padrão interno, em vez de padrões externos, por exemplo, Nva (norvalina), é recomendada.
• O padrão interno deve ser adicionado antes da hidrólise. Ele pode ser adicionado durante o preparo da amostra, se apropriado, ou acrescentado ao ácido que é então adicionado aos tubos de hidrólise. Normalmente, a quantidade de padrão interno é calculada para coincidir com a quantidade padrão utilizada para calibração.
• O fenol é adicionado ao ácido que é utilizado para a hidrólise, para atuar como um removedor de oxigênio.

2.1.2 Diluição da amostra (se necessário) antes da hidrólise do líquido

• Adicione um mínimo de 10 µL de amostra (diluída ou não) ao tubo de hidrólise. Qualquer quantidade menor contribuirá com um volume inaceitável de erro devido à incerteza volumétrica.
• Na hidrólise, também deve haver um excesso de peso de ácido de 10 a 100 vezes o da amostra. Com uma amostra excessivamente concentrada, a hidrólise pode não funcionar de forma eficaz. Nesses casos, a amostra deve ser diluída. Certifique-se de que haja um excesso de aproximadamente 100 vezes o peso de ácido sobre sólidos em hidrólises líquidas.
• Certifique-se de que haja um excesso molar de 25 vezes de ácido sobre os tampões na amostra. Multiplique os moles de tampão de fosfato por 3 para contabilizar os três grupos tituláveis.
• O volume total para hidrólise não deve exceder 50% da capacidade total de um tubo ou recipiente de hidrólise. Para tubos de 6 x 50 mm, o volume máximo recomendado é de 100 µL. Inclua os volumes de ácido e padrão interno neste volume total final.

Exemplo de cálculo: Determinação do requisito de diluição

Para uma proteína de 5 mg/mL em 150 mM NaCl, a quantidade de sólidos (incluindo sais) e o fator de diluição serão determinados.

A primeira etapa é determinar a quantidade total de sólidos na amostra. Isso pode ser feito pela multiplicação da concentração de proteína (µg/µL) pela concentração em peso do sal (concentração x MW) para uma quantidade total de sólidos.

A próxima etapa é determinar a diluição necessária para o destino de 20 µg de proteína (em 20 µL). Isso pode ser feito pela multiplicação da quantidade/volume desejado pela concentração inversa da amostra. Isso resulta em uma razão de diluição de 1:5 necessária para a amostra descrita acima.

2.1.3 Volume de amostra para dispensar ao tubo de hidrólise

O volume total recomendado para uma hidrólise é de 100 µL (ao utilizar tubos de 6 x 50 mm), com o volume de amostra que varia de 10 a 20 µL. Esse volume de amostra, diluído ou não, depende do tipo de hidrólise realizada e segue estas diretrizes:

• Hidrólise em fase de vapor: seque a amostra a vácuo como uma película fina no fundo do tubo de hidrólise.
• Hidrólise líquida: dispense o volume apropriado para hidrolisar pelo menos 2 µg de proteína no tubo de hidrólise ou, a partir de uma quantidade maior de amostra (até 25 µg de proteína), reconstitua com HCl 0,1 N suficiente para transferir aproximadamente 0,2 µg de proteína (idealmente em 10 µL) para a hidrólise.

É importante observar, novamente, que quanto menor for a quantidade de proteína na alíquota da amostra, mais vulnerável a análise poderá ser à contaminação.

2.1.4 Volume de ácido a ser adicionado à hidrólise

O volume de ácido adicionado à hidrólise é essencial. Isso vale particularmente para a hidrólise em fase líquida. As diretrizes para o volume de ácido estão abaixo, com um exemplo extenso.

• Hidrólise em fase de vapor:
  • Adicione 200 µL de HCl 6 N com 0,1–0,5% de fenol ao fundo do recipiente de hidrólise. (Se estiver utilizando uma workstation comercial para hidrólise, adicione o volume recomendado pelo fornecedor. Para obter informações adicionais, consulte as Seções 4 e 5.)
• Hidrólise em fase líquida (consulte o exemplo abaixo):
  • Certifique-se de que a concentração final de ácido seja de 6 N (com fenol adicionado).
  • Certifique-se de que o excesso molar de ácido seja suficiente (aproximadamente 25 vezes) para neutralizar os tampões.
  • Certifique-se de que o excesso de peso de ácido sobre os sólidos totais seja suficiente (aproximadamente 100 vezes). Nessa estimativa, inclua a matriz da amostra e outros sólidos juntamente com a proteína.

Exemplo de cálculo: Determine o volume de ácido a ser adicionado a uma hidrólise líquida

Seguindo as diretrizes acima, a quantidade mínima de ácido adicionada para uma hidrólise deve exceder 25x a concentração do tampão e 100x o excesso de peso da amostra. Portanto, para determinar o volume de ácido necessário, é preciso calcular o seguinte:

1. Quantidade de tampão presente
2. Quantidade de ácido necessária para neutralização (25x) do tampão na amostra
3. Converta a quantidade de ácido em volume
4. Sólidos totais na amostra
5. Quantidade mínima de ácido necessária para fornecer o excesso de ácido de destino sobre a amostra (100x)
6. Converta a quantidade de ácido em volume
7. Quantidade total de ácido necessária (soma de neutralização e excesso)

Para uma proteína de 2,1 mg/mL em 2 mM Na/K₂PO₄:

A quantidade de tampão em cada tubo é determinada pela multiplicação da concentração molar do tampão pelo número de grupos tituláveis (três para o tampão de fosfato) e ajustando-se ao volume total da amostra dispensada — nesse caso, 10 µL.

Cada tubo conterá 60 nmol de tampão.

Em seguida, o excesso de 25 vezes é determinado pela multiplicação da quantidade por 25.

Esse número é a quantidade de moles de ácido tampão necessária para uma neutralização eficaz.

Os moles de tampão necessários para a neutralização devem ser convertidos em um volume de ácido para adicionar a cada tubo.

Para esta amostra, um volume de 0,25 µL neutralizará efetivamente o tampão.

Para atingir o excesso de 100x de ácido sobre a amostra, a quantidade total de sólidos na amostra deve ser determinada. Os sólidos totais será a proteína mais o tampão mais qualquer outro material presente. Neste caso, a amostra é uma proteína purificada.

Essa determinação pode ser feita pela multiplicação da concentração de proteína (µg/µL) pela concentração em peso do sal (concentração x MW) para uma quantidade total de sólidos.

Os sólidos totais para esta amostra são calculados em 24,9 µg.

Para determinar o excesso de destino de 100 vezes de ácido, multiplique os sólidos totais por 100.

Por fim, converta o excesso de peso em um volume de HCl 6 M para adicionar a cada tubo pela multiplicação do peso pelo peso por mole do ácido pela molaridade do ácido.

Nesse caso, 11,4 µL de HCl 6 M fornecerão um excesso de 100 vezes de ácido sobre a amostra.

O volume final de ácido a ser adicionado a cada tubo é a soma dos volumes necessários para neutralizar o tampão de amostra e fornecer o excesso de 100 vezes:

É necessário um volume de 11,65 µL de HCl 6 M para garantir uma hidrólise eficaz. Esse volume pode ser arredondado para um volume que possa ser transferido com exatidão.

2.1.5 Padrão interno (IS, Internal Standard)

A utilização de um padrão interno (IS, Internal Standard) compensa melhor a hidrólise variável dos aminoácidos individuais da amostra. A norvalina (Nva) é um padrão interno comumente utilizado.

Ao utilizar um padrão interno:

• Ele pode ser preparado e dispensado com a amostra.
• Ele pode ser adicionado separadamente da amostra.
• Pode ser preparado e dispensado com o ácido.
• Certifique-se de preparar o padrão interno de forma que o volume de injeção de 1 µL no equipamento forneça a mesma quantidade na coluna que a amostra.

Para determinar a quantidade de IS necessária na amostra inicial, o cálculo retorna a partir da quantidade desejada de IS necessária na amostra. Como parte desse cálculo, é importante considerar a etapa de derivatização.

Exemplo de cálculo: Determine a quantidade de padrão interno para uma amostra

O IS total é determinado, trabalhando retroativamente, multiplicando a quantidade de IS necessária na amostra final, o fator de diluição da derivatização e a amostra reconstituída no tubo de hidrólise. Neste exemplo, são necessários 25 pmol de IS na amostra final derivatizada, com a amostra sendo diluída 10x durante a derivatização e 5x a diluição da amostra antes da derivatização. Assim:

Isso indica que precisamos de 1250 pmol de IS em nossa amostra de hidrólise.

Dado o MW (mg/mol) e a conversão de µL em mL, podemos ver que precisamos de 0,14 mg de IS adicionado a cada mL de nossa amostra inicial.

2.1.6 Hidrólise ácida em fase de vapor

A hidrólise em fase de vapor é recomendada para amostras de proteína ou peptídeo relativamente puras contendo pouco ou nenhum material particulado. É considerada a abordagem mais sensível. Uma workstation de hidrólise autônoma e automatizada é recomendada para esse tipo de hidrólise. O controle de vácuo, a manutenção da temperatura, as descargas de nitrogênio e a secagem da amostra exigidas no procedimento são melhor realizadas por um sistema automatizado, como a Workstation Eldex de hidrólise descrita na Seção 4.

Reagentes:

• HCl 6 N com 1% de fenol por volume
• Nitrogênio (grau pré-purificado)
• Gelo seco

Observação: Para obter informações adicionais sobre o reagente, consulte o manual operacional da workstation de hidrólise.

Procedimento (baseado na utilização de uma workstation automatizada):

1. Seque uma alíquota contendo 0,5–20 µg de proteína em um tubo de hidrólise de 6 x 50 mm.
2. Adicione 200 µL de HCl em ebulição constante contendo 0,5% de fenol no fundo do vial a vácuo (consulte a dica abaixo).
3. Vede o vial sob vácuo após três etapas alternadas de lavagem com nitrogênio a vácuo.
4. Hidrolise a 112–116 °C por 24 horas.
5. Resfrie o vial; remova o excesso de HCl da parte externa dos tubos limpando-os com um lenço de papel para laboratório; seque sob vácuo.

Dicas:

• Utilize fenol cristalino e coloque um cristal (≈0,5 mg) no fundo do vial. O cristal é mais limpo e estável do que o fenol liquefeito.
• Pipete cuidadosamente a amostra e o padrão interno para o fundo dos tubos; utilize uma seringa para maior exatidão e facilidade de aplicação.
• É possível rotular os tubos marcando-os com um fichário ou lápis de ponta de diamante.
• Evite que as gotículas de HCl sejam drenadas para os tubos. Mantenha os tubos na posição vertical no vial a vácuo. Com menos de 10 a 12 tubos, adicione tubos em branco para suporte. É recomendado inclinar levemente o vial durante o resfriamento.

Observação: Uma cor marrom no HCl é comum após a hidrólise. Ela é proveniente do fenol. O etanol ou a acetona funcionam bem para remover a descoloração de vials e tampas.

CUIDADO: Os problemas de hidrólise podem ser difíceis de distinguir dos problemas de derivatização.

2.1.7 Hidrólise ácida em fase líquida

A hidrólise em fase líquida é utilizada quando as amostras são mais complexas. Nesse caso, há partículas ou outros materiais estranhos que podem interferir no processo de fase de vapor. Essa abordagem é considerada menos sensível em geral; mas, quando realizada com cuidado e precisão, pode dar bons resultados.

• Equipamentos e reagentes necessários para esta metodologia:
• Balança analítica
• Forno ou bloco de aquecimento capaz de manter a temperatura definida ± 0,1 °C
• Misturador em vórtice
• Pipetas volumétricas
• Micropipetas ajustáveis
• Tubos de hidrólise com tampas, 6 x 50 mm recomendados
• Fonte de nitrogênio para lavagem
• HCl 6 N

Procedimento:

Antes de começar –

Pese as amostras correspondentes a aproximadamente 20 mg de proteína para o 0,1 mg mais próximo em tubos de hidrólise ou transfira a amostra diluída para os tubos (conforme calculado nas Seções 2.1.3 e 2.1.4). Normalmente, um volume total de 10 µL é o normal. Misture.

1. Adicione precisamente o volume correto de padrão interno, calculado na Seção 2.1.5, aos tubos de hidrólise. Misture.
2. Adicione um excesso de HCl 6 N (calculado na Seção 2.1.4, Etapa 3), misture e purgue com nitrogênio por 30 segundos. Tampe imediatamente.
3. Coloque no forno em 110 °C por 24 horas. (Esses parâmetros devem ser o resultado de um estudo de curso de tempo para a proteína e os aminoácidos de interesse.)
4. Retire do forno e deixe esfriar.
5. A amostra está pronta para mover-se para a etapa de derivatização.

2.1.8 Solução de problemas da hidrólise ácida

Vários aminoácidos são afetados pela hidrólise inadequada. Por exemplo:

• Os baixos rendimentos de metionina (Met) e tirosina (Tyr) são geralmente sintomáticos de um procedimento de hidrólise insatisfatório — HCl impuro ou a remoção inadequada de oxigênio. Qualquer um desses problemas pode levar à formação de cloro e à subsequente cloração de Tyr.
• Rendimentos baixos dos aminoácidos hidrofóbicos (Ile, Leu, Val e outros) podem indicar hidrólise incompleta, causada por baixa temperatura do forno, tempo de hidrólise reduzido (especialmente se uma hidrólise rápida de alta temperatura estiver sendo utilizada) ou perda de HCl resultante do excesso de evacuação após a purga com nitrogênio (isso pode ser um problema específico da amostra; algumas sequências, como lle-Val-Leu, são extremamente resistentes à hidrólise). Verifique se o HCl líquido permanece visível no vial antes de colocá-lo no forno. O HCl em excesso também pode ser um problema; o líquido pode condensar na amostra e resultar em um resíduo marrom, perda de Tyr e Met e aparecimento de picos dispersos.
• Se uma workstation de hidrólise em fase gasosa não estiver sendo utilizada, certifique-se de que a configuração para hidrólise seja adequada. O vial inteiro de hidrólise deve ser fechado no forno; a utilização de um bloco de aquecimento que envolva apenas a metade inferior do vial resultará na condensação de HCl líquido na parte superior, e a hidrólise será ineficaz. 

A análise de Trp em proteínas e peptídeos é complicada pela instabilidade deste aminoácido em condições normais de hidrólise com HCl 6 N. Procedimentos alternativos de hidrólise podem ser utilizados para gerar Trp intacto para análise:

• Hidrólise de ácido sulfônico (por exemplo, ácidos metanossulfônicos e p-toluenossulfônicos)
• Hidrólise básica e a utilização de reagentes tiol em HCl, como B-mercaptoetanol (BME) ou ácido tioglicólico

2.2.1 Hidrólise de ácido metanossulfônico (MSA, Methanesulfonic Acid) para análise de triptofano

O reagente MSA deve ser adicionado diretamente aos tubos de amostra de 6 x 50 mm (hidrólise em fase líquida), porque o ácido não é volátil. A adição de metanol e a neutralização após a hidrólise fornecem bons resultados para o triptofano e não interfere em nenhum processo de derivatização subsequente. A Figura 2 ilustra a reação do MSA com a proteína.

Observação: Este procedimento também pode ser utilizado para determinação de Cys e Met. Ele converte Cys em Cya e Met em metionina sulfona.

Observação: O Trp não é estável no procedimento de oxidação com ácido perfórmico tradicionalmente utilizado para análise de Cys e Met.

2.2.1.1 Equipamentos e reagentes

• MSA 4 M contendo 0,2% (w/v) de triptamina HCl
• Água ultrapura
• Metanol-água-trietilamina, 2:2:1
• Tubos de hidrólise, 6 x 50 mm
• Equipamento de secagem a vácuo
• Banho-maria ou bloco de aquecimento

2.2.1.2 Procedimento

1. Adicione 20 µL de MSA 4 M contendo 0,2% (w/v) de triptamina HCl a cada tubo de amostra de 6 x 50 mm contendo amostra seca.
2. Adicione 100 µL de água ao vial de reação.
3. Vede para hidrólise.
4. Hidrolise a 110 °C por 20–24 horas.
5. Resfrie, abra o vial e adicione 22 µL de KOH 4 M (o suficiente para neutralizar) a cada tubo de amostra.
6. Seque sob vácuo.
7. A amostra está pronta para derivatização.

Dicas:

Verifique se há interferências com as amostras em branco de controle.

• Use MSA novo e puro.
• Pode ser que parte da interferência que ocasionalmente obscurece Tyr ou Val venha da triptamina que é utilizada como aditivo no ácido comercial. A utilização de MSA sem o aditivo pode ser uma solução.
• Use KOH novo (ou substitua o NaOH, se achar que é mais limpo em seu laboratório). Teste a capacidade da base de neutralizar o ácido em uma amostra de teste. Adicione um volume de base que mantenha o excesso de base no mínimo.
• Faça um padrão de Trp de 2,5 µmol/mL em H20. Armazene no freezer. Misture o padrão de Trp 1:1 com o padrão de H para utilização em calibração.

ATENÇÃO:

• Pode ocorrer interferência com Tyr e Val. A causa é desconhecida. (O HCl é preferível para a hidrólise de Tyr.)
• Os baixos rendimentos de Met são uma função das condições de hidrólise.
• Os rendimentos de Trp e Met não são lineares devido ao processo de hidrólise, não ao procedimento de análise. À medida que a quantidade hidrolisada é reduzida, os rendimentos diminuem; com Met, o resultado é mais significativo.
• Baixa reprodutibilidade dos resultados de Arg — causa desconhecida.

2.2.2 Hidrólise alcalina para análise de triptofano

Se a hidrólise ácida de triptofano levantar problemas de estabilidade, a hidrólise de proteína utilizando base é outra alternativa.

• NaOH
• Ácido acético
• Água ultrapura
• Tubos de hidrólise, 6 x 50 mm
• Equipamento de secagem a vácuo
• Banho-maria ou bloco de aquecimento

1. A utilização de tubos de plástico (por exemplo, Teflon) pode ser necessária para evitar a formação de silicatos e subsequentes problemas de solubilização ou derivatização.
2. Adicione 20 µL de NaOH 4 M fresco diretamente ao tubo de hidrólise como no procedimento de MSA acima.
3. Vede o tubo e aqueça a 112 °C por 16 horas.
4. Resfrie e neutralize com excesso de ácido acético.
5. A amostra está pronta para derivatização.
6. Execute brancos para determinar o nível de contaminação.
7. Verifique o método em padrões e amostras conhecidas.

A quantificação de cisteína (Cys) em amostras de proteína é prejudicada pela instabilidade desse aminoácido em condições padrão de hidrólise ácida. Infelizmente, ao contrário do Trp, as hidrólises ácidas ou básicas alternativas não são satisfatórias. Dois procedimentos comuns para análise de Cys envolvem a conversão da cisteína em derivados mais estáveis. O primeiro procedimento é a alquilação do grupo sulfidrila, e o segundo é uma oxidação no ácido sulfônico, ácido cisteico ou cianúrico (Cya) estável em ácido.

ADVERTÊNCIA: Uma complicação adicional na análise de Cys é que grande parte do aminoácido está presente como o dímero, cistina (Cys2), que deve ser reduzido a cisteína antes de qualquer procedimento de alquilação.

É importante observar que esses procedimentos específicos são realizados antes da etapa de hidrólise ácida padrão.

O ácido perfórmico é um poderoso reagente de oxidação que converte quantitativamente a cisteína (Cys) e a cistina (Cys2) em ácido cisteico (Cya) (Figura 4). A literatura contém muitas referências à utilização desse reagente em uma ampla variedade de condições e procedimentos. O procedimento a seguir é baseado no de Tarr, G.E., 1986.

Observação: Este procedimento produz os resultados mais exatos para cisteína e metionina.

• Equipamento de secagem a vácuo
• Tubos de hidrólise de 6 x 50 mm com tampas
• Ácido fórmico ultrapuro
• Peróxido de hidrogênio ultrapuro
• Balança analítica
• Micropipetas

1. Seque a amostra a vácuo (0,1–10 µg de proteína ou 50–2000 pmol de peptídeo) em um tubo de hidrólise de 6 x 50 mm.
2. Misture 19 volumes de ácido fórmico 97% com 1 volume de peróxido de hidrogênio; deixe repousar coberto por uma hora a 22 °C.
3. Adicione 10 µL desse reagente à amostra seca, deixe repousar por 30 minutos a 22 °C e seque a vácuo.
4. Hidrolise utilizando o procedimento padrão de HCl 6 M (Consulte a Seção 1.1).

Observação: O Tyr e o Trp não são estáveis neste procedimento de oxidação.

Os procedimentos que alquilam são mais seletivos do que a oxidação com ácido perfórmico e resultam em pouca ou nenhuma alteração nos outros aminoácidos. Isso os torna mais adequados para a análise da proteína completa, bem como para outros procedimentos que podem seguir a modificação de Cys, como o mapeamento de peptídeos.

Nesse método, a alquilação é apresentada com 4-vinilpiridina; o procedimento geral descrito abaixo também pode ser adaptado para vários agentes alquilantes. Em princípio, um reagente redutor suficiente deve ser adicionado à amostra para converter cistina (Cys2) em cisteína (Cys). Depois disso, é feita uma adição de reagente alquilante em excesso à amostra reduzida (Figura 5).

• Secador a vácuo, fonte de secagem de nitrogênio ou liofilizador
• Vials que podem ser vedados novamente
• Balança analítica
• Medidor de pH
• Micropipetas
• Piridiletil cisteína (PEC, Pyridylethyl Cysteine) como padrão
• Guanidínio HCl (Gu-HCl)
• Ditiotreitol (DTT, Dithiothreitol)
• 4-vinilpiridina (4-VP)
• Acetato de N-etil morfolínio
• Ácido acético ultrapuro
• Padrão de aminoácidos (PN: WAT088122)

1. Adicione água a 6,4 mL de N-etil morfolínio para levar o volume a 100 mL.
2. Titule para o pH 8,3 com ácido acético.

O procedimento a seguir pode ser utilizado para 1–1000 nmol de proteína ou peptídeo.

1. Coloque a amostra em um vial vedável; secagem a vácuo, N₂ ou liofilização.
2. Dissolva a amostra em 1 mL de tampão.
3. Adicione 1 g de Gu-HCl. Misture.
4. Adicione 4 mg de DDT. Misture.
5. Cubra a amostra com N₂, vede firmemente e incube em temperatura ambiente por 4 horas.
6. Adicione 8 µL de 4 VP, cubra com N₂, vede e incube em temperatura ambiente por 4–16 horas.
7. Adicione 3 mL de água.
8. Dessalinize.
9. A amostra agora pode ser hidrolisada com ácido.

Observação: O volume total de reação pode ser diminuído por meio da redução do tampão para 0,25 mL, o Gu-HCl para 250 mg, DTT para 1 mg e 4-VP para 2 µL. Isso é adequado para até 250 pmol de amostra. Após a alquilação, dilua com 750 µL de H₂0 e prossiga.

1. Faça uma solução de 2,5 mM de piridiletil cisteína (PEC, Pyridylethyl Cysteine).
2. Adicione 200 µL de padrão de aminoácido a 200 µL.
3. Derivatize 10 µL da mistura de calibração de PEC combinada.
4. Reconstitua em 100 µL; injete 4 µL para calibrar no nível de 250 pmol.

Observação: 8 µL de 4 VP são aproximadamente 74 µmol. A substituição de outros reagentes de alquilação por 4-VP (por exemplo, ácido iodoacético) no procedimento pode ser feita utilizando a mesma concentração de reagente.