製備級液相層析入門讀本

1. Antioxidant Isolation Using the Prep 150 LC System（使用Prep 150 LC系統分離抗氧化劑）。
2. Peptide Isolation Using the Prep 150 LC System（使用Prep 150 LC系統分離胜肽）。
3. Purification of Cannabinoid from Hemp Oil Using the Prep150 LC System（使用Prep150 LC系統從大麻油中純化製備大麻素）。
4. Isolation of Flavonoids from Ginko Biloba Leaf Using the Waters Prep 150 LC System（使用Waters Prep 150 LC系統從銀杏葉中分離黃酮類化合物）。
5. Isolation of a Natural Product from Echinacea Extract Using the Prep 150 LC（使用Prep 150 LC系統從紫錐菊萃取物中分離天然物）。
6. Streamlining Compound Isolation Automatically with UPLC to Prep Chromatography Using Mass-Directed AutoPurification（使用UPLC到製備級層析分離法以質譜導向的自動純化自動簡化化合物分離的程序）。
7. Mass-Directed Isolation of a Synthetic Peptide Using the ACQUITY QDa Detector（使用ACQUITY QDa偵測器對合成胜肽進行質量導向分離）。
8. Strategies for Improving Isolation Using Large Volume Leading and Easy Method Development in Prep Chromatography（使用製備級層析分離法中的大量上樣和簡易方法開發改進分離的策略）。
9. Techniques for Improving the Efficiency of Large Volume Loading in Prep Liquid Chromatography（製備級液相層析法中提高大量上樣效率的技術）。
10. Mass-Directed Isolation of Sulfa Compounds from an Antibiotic Mixture with an ACQUITY QDa Detector（使用ACQUITY QDa偵測器對磺胺類化合物與抗生素混合物進行質量導向分離）。
11. Mass Directed Isolation pf a Pharmaceutical Compound Using AutoPurify with an ACQUITY QDa Detector（使用ACQUITY QDa偵測器以自動純化對藥物化合物進行質量導向分離）。
12. Typical Conditions for Analyzing and Isolating the Compounds in the Prep Chromatography Mixture Standard with an ACQUITY QDa Detector（使用ACQUITY QDa偵測器對製備級層析分離混標中的化合物進行分析和分離的典型條件）。
13. Preparatory Chromatography of Natural Product Extracts Utilizing a UV-Based Open Access Walk-up Purification Strategy（天然物萃取物的製備級層析分離運用紫外線的開放存取直接純化策略）。
14. A modular Prep HPLC System for the Isolation of Puerarin from Kudzu Root Extracts（從葛根萃取物中分離葛根素的模組式Prep HPLC系統）。
15. Improving Resolution and Column Loading Systematically in Prep Liquid Chromatography for Isolating a Minor Component from Peppermint Extract（全面提高製備級液相層析分離中的解析度和管柱上樣量，以便從薄荷萃取物中分離微量成分）。
16. Small Scale Peptide and Impurity Isolation Using the ACQUITY UPLC H-Class and Waters Fraction Manager-Analytical Systems（使用ACQUITY UPLC H-Class和Waters Fraction Manager-Analytical系統進行小規模的胜肽和不純物分離）。
17. Small Scale Purification of Constituents from Complex Natural Product Extracts Using ACQUITY H-Class and Waters Fraction Manager- Analytical Systems（使用ACQUITY H-Class和Waters Fraction Manager- Analytical系統從複雜天然物萃取物中小規模純化成分）。
18. 管柱內稀釋, 應用手冊, 改版A, Waters Corp, 2003。如需實用應用說明和參考資料的更多資訊，請造訪www.waters.com，並在搜尋框中輸入上方的藍色參考編號。 

結論：

• 管柱內稀釋 -是一項專利進樣技術，能讓樣品在管柱頭以強溶劑進行稀釋，藉此增加質量容量、提高解析度、延長管柱使用壽命，並改善LC系統的耐用性。層析分離 - 偵測器訊號值或其他定量的圖形或其他表示形式，做為量測流出物中分析物濃度與流出量或時間的關係。管柱體積(V_c), V_c = π x (r)² x 高度 x 66%（可用於移動相的比例）/1000，以將mm³轉換為mL – 管子含有填料部分的幾何體積（管內橫截面積乘以填充床長度L，再乘以補償填充材料佔用的空間，66%），一小部分流量流向偵測器，主要部分流向餾分收集器。這種情況下，滯留體積仍然存在，但由於移動相濃度不變，因此在不同滯留體積的系統上運作的層析圖之間沒有觀察到分離差異。洗脫液、沖提液、洗脫 – 洗脫液是指從管柱出口流出或洗脫的溶析液部分，含有溶液中的分析物。在分析級HPLC中，偵測器會檢查溶析液中分析物的濃度或質量。在製備級HPLC中，會以均勻時間或體積間隔連續收集溶析液，或僅在偵測器指出預定波峰出現時才停止收集。這些餾分後續會進行處理，得出純化的化合物。疏水性 - 非極性自由基或分子所具有的特性，在有機溶劑中比在水中更易溶解。離子交換層析 – 離子交換層析（或離子層析）是一種層析分離過程，根據離子和極性分子對離子交換劑的親和力來加以分離。分離技術用於任何類型的帶電分子，例如大分子蛋白質、小分子核苷酸和氨基酸。等度 – 移動相組成在層析分離過程中保持不變。補充溶劑 – 在質量導向純化系統中，用於稀釋從製備流中分流出來的樣品並將其轉移到偵測器的溶劑。移動相 – 用於從HPLC管柱中洗脫化合物的溶劑。流速 – 單位時間內通過管柱的移動相體積。進樣器（自動進樣器、樣品管理器） – 一種將預定體積的樣品溶液精準無誤地引進（進樣）流動中移動相流的機制。等度洗脫 – 在洗脫過程中移動相組成保持不變。移動相 – 在固定相吸著劑層床的長度上以特定方向流動的流體。波峰 – 當一個成分從管柱中流脫出來時，偵測器訊號值的記錄。解析度(Rs) – 兩個波峰的分離表示為對應滯留時間的差異除以基線處的平均峰值寬度。R_s=1.25表示兩個等寬的波峰剛好在基線處分離。當R_s=0.6時，層析圖中兩個波峰的唯一視覺表示是，峰頂點附近的一個小缺口。滯留時間(RT) – 進樣開始或樣品引入到出現波峰最大值之間的時間。選擇性 – 此詞彙用來說明針對組成分離系統的特定移動相和固定相，一對分析物的相對親和力之間差異的數量級。規模（升級） – 每次分離所需的純化分離物數量決定了規模、管柱直徑、系統和硬體要求。數量範圍包括，分離或純化少量微克級別的酶到工業藥物製造營運所需的大量公斤數。升級是在特定化合物的潛在價值經過初步證明之後，增加數量供進一步評估。階段式梯度 – 一種分離方法，會在較平緩的部分（聚焦部分）前後保持相同的斜率，進而能保留這些分離部分的層析分離特徵，通常用於測定系統滯留體積。矽烷醇 – 鍵結至矽膠基質管柱填充材料上的化學基團，可與樣品交互作用。分流器 – 用於將一小部分樣品流轉移到具破壞性的偵測器，例如採用質譜的純化。固定相 – 填充在玻璃或金屬管中或構成開管毛細管壁的多孔隙固體（例如玻璃、矽膠或氧化鋁）；移動相流經填充層床或管柱，待分離樣品進樣到管柱開頭，由移動相輸送到整個系統；不同的物質會根據其對兩相的相對親和力來展開分布。通量 – 使用更小體積、更小顆粒的分析級管柱，或大體積、大顆粒的製備級管柱，以更高的線性速度進行LC分離處理的優勢；解析度越高、速度越快，效率越好，通常通量也會更高；每次運作或每個處理週期可以純化更大量的化合物。

詞彙

1. 系統體積 – 從移動相溶劑混合點到抵達管柱頭的滯留體積、延遲體積、系統體積；若是高壓混合LC系統，那麼混合器、連接管和自動進樣環就是主要組件，只有對梯度應用才有實際意義。
2. 分流比 – 在質量導向純化過程中，從樣品流中連續「去除」和稀釋後轉移到偵測器中的樣品量。
3. 粒徑篩析層析 – 根據化合物在溶液中的大小進行層析分離的方法。
4. 平緩梯度 – 每管柱體積的有機溶劑濃度變化率較慢的梯度，用於分離對管柱基質具有相似親和力的化合物。
5. 分段梯度 – 包括多個不同斜率之梯度的分離方法，以分離不同選擇性的多種化合物，提供最高的通量。
6. 靈敏度(S) – 進入偵測器的移動相中，物質的單位濃度或單位質量的訊號輸出，若是質量流敏感型偵測器，靈敏度就是峰高與單位質量的比率。
7. 逆相層析分離 – 液相層析中使用的一種洗脫程序，其中移動相的極性明顯高於固定相。
8. 滯留因子(k) – 量測樣品成分滯留在固定相中的時間相對於滯留在移動相中的時間，表示樣品成分受到固定相阻滯的時間相比以移動相速度通過管柱所需的時間有多長。
9. 製備級層析分離 – 使用液相層析來分離一定數量和純度等級的化合物，以供進一步實驗或使用的過程。
10. 被動分流器 – 用於以規定的分流比對主流量或製備流進行連續採樣的裝置，可管理質量導向純化中的偵測器訊號。
11. 液相層析(LC) – 一種移動相為液體的分離技術。
12. 進樣端 – 移動相液流和樣品進入管柱層床的一端。
13. 梯度– 兩種（或更多）可溶溶劑成分的相對濃度會隨時間變化，形成洗脫強度增加的移動相。
14. 移動相修飾劑 – 混合到層析分離溶劑中以改善分離效果的添加劑。
15. 載樣量 – 也稱為「上樣量」；可以進樣到管柱中並使相關化合物充分保持解析度的最大材料量。
16. 線性梯度 – 移動相組成在規定的一段時間內以恆定速率改變的分離方法。
17. 游離 – 分子獲得或失去電子以形成離子而獲得負電荷或正電荷的過程。
18. 親水性 – 由於具有強極性基，容易與水或極性溶劑溶解或交互作用。
19. 平衡 – 對於採用梯度的層析分離方法，必須要有運作後的平衡時間，讓管柱和系統恢復到初始移動相條件，方便下次進樣使用。為達到充分平衡，在方法開始條件下，應以5倍的總管柱體積(CV)加上3倍的系統體積（滯留）沖洗管柱。梯度層析分離管柱的重新平衡, 效能觀點, Waters Corp. 1998。梯度斜率 – 梯度分離過程中每管柱體積的有機溶劑組成變化率。
20. 效率 – 量測管柱在通過填充床時阻止樣品譜帶擴散的能力。高效管柱可將譜帶擴散或譜帶分散的作用降到最低。效率高，才能有效分離、提高靈敏度和/或鑑定複雜樣品混合物中的類似成分。
21. 滯留體積 – 從移動相溶劑混合到抵達管柱頭的系統體積；若是高壓混合LC系統，那麼混合器、連接管和自動進樣環就是主要組件；等度分離的移動相成分以線上方式混合。
22. 偵測器 – 一種以量測物理或化學特性（例如，紫外線/可見光吸光度、示差折射率、螢光或導電度），指出溶析液組成變化的裝置。某些偵測器（例如電化學、質譜分析）具有破壞性，也就是說會影響樣品成分的化學變化。如果偵測器對樣品具有破壞性，就需要使用分流器來轉移樣品。
23. 層析分離 – 一種分離方法，要分離的成分分布在兩相之間，一個是靜止的（固定相），而另一個（移動相）會相對於固定相移動。
24. 發色團 – 吸收某些可見光波長並透射或反射其他波長的某種分子部分。發色團是分子中兩個不同分子軌道之間的能量差，落入可見光譜範圍內的區域。因此，可將電子從基態激發成激發態，藉此吸收撞擊發色團的可見光。

參考資料

• 製備級層析分離已成為一種寶貴的技術，加惠了製藥、天然物分離和其他需要產生純化材料的重要操作。充分運用該技術的關鍵，就是提高方法開發的品質。純化系統配備了適合大規模純化的硬體和軟體後，從小規模到大規模的方法轉移就成為了常規操作。 
  • Sarker, S., Latif, Z., Gray, A., 「Natural Products Isolation」 Second Edition.Humana Press.2006.
  • Aubin, A. "UV-Directed Purification of a Small-Scale Organic Synthesis," Waters Corporation, Milford, MA USA.2008.
  • Diehl, D. Fountain, K. Wheat, T. Joblonski, J. Yin, Z. Morrison, D; Collier, S. Murphy, B. Cleary, R. Compagnon, L., "Practical Chemistry Considerations for Purification."Waters Presentation.2008.
  • Dolan, J. 「A Guide to HPLC and LC-MS Buffer Selection.」Advanced Chromatography Technologies. www.ace-HPLC.com.
  • Jablonski, J et.al.「Effective Use of Temperature Control in Compound Isolation.」Waters Corporation, Milford, MA USA.
  • "At-Column-Dilution, Application Notes", Waters Corp, 2003.
  • 如需更多有關實用應用手冊和參考資料的資訊，請造訪www.waters.com，並在搜尋方塊中輸入以上藍色參考編號。