製備級液相層析入門讀本

分離過程變得複雜雖然多半是受到管柱填充材料選擇性的影響，但在開發以純化為目標的分離方法時，先以快速偵察梯度產生樣品分離方法再進行最佳化是最有效的。偵察梯度的目標是大致測定從管柱中洗脫相關化合物所需的溶劑濃度。偵察梯度通常會從相同的強溶劑濃度(2–10%)開始，然後線性增加到25%、75%、50%和90–95%。

完成偵察梯度後，在進行下一步之前，透過一系列問題來審查和評估結果：

• 快速偵察梯度能否為相關化合物提供足夠的分離效果？
• 快速偵察梯度的速度或效率是否滿足要求？
• 能否以所需的上樣量分離相關化合物與其他波峰？

如果偵察梯度的結果不符合要求，可透過聚焦方法進行最佳化，或者透過更改pH值、溶劑或其他層析分離變數，對分離方法進行整體改造。

方法最佳化

修改強溶劑和弱溶劑的組成可實現最佳化處理，讓偵察運作為相關化合物提供最大解析度。溶劑組成可以保持不變（等度），也可以按指定的單位時間或管柱體積（梯度）來變更。

等度洗脫

在等度分離中，弱溶劑和強溶劑的比例於單位時間內保持不變。分析人員可以離線製備等度溶劑，或者使用能以恆定的預定速率配比不同溶劑的HPLC幫浦進行線上混合。這種洗脫模式既方便一致又穩定，因為在系統之間轉移方法時，滯留體積對滯留時間的影響可以忽略不計。

等度洗脫有些缺點，可能不適用於所有分離情況。固有問題包括：早期洗脫波峰的解析度差、波峰拖尾導致對稱性降低、譜帶擴展導致靈敏度降低，以及滯留性強的化合物堆積導致管柱污染問題。

梯度洗脫

逆相或離子交換中的梯度分離通常需要線上混合移動相，讓有機溶劑比例在整個分析過程中穩定增加。梯度開始時，溶劑強度較低，分析物會被分配到固定相中或留在管柱頭。隨著溶劑強度增加，分析物會轉移到移動相中，沿管柱移動，最後洗脫出來。

梯度洗脫可在合理的時間範圍內分離具有廣泛疏水性的分析物，此外，還可以提高波峰解析度，峰高增加讓靈敏度也得到提升。滯留性強的成分會在運作結束時從管柱中洗脫，因此還可以有效避免管柱劣化。

梯度洗脫也有些缺點，比如需要一致無脈衝的線上梯度混合，因此通常要使用昂貴的幫浦儀器。不僅如此，當某些移動相以某種組合混合時，可能會發生沉澱現象。由於梯度結束後需要重新平衡，因此運作時間可能會很長，而且因為儀器的滯留時間(Vd)有所變化，若沒有足夠的補償，方法轉移會出現問題。

線性梯度

在整個運作過程中，線性梯度的強溶劑組成比例以恆定速率增加。這種方法通常用於快速篩選實驗，以便能快速測定洗脫目標波峰的溶劑比例，並讓運作時間保持在合理的短時間內，進而能以更少的時間、更低的溶劑成本快速完成洗脫。

分段梯度

分段梯度是一系列線性梯度的組合，每段梯度有不同的斜率或陡度。平緩區段可解析相關化合物，而陡峭區段則是層析圖中不需要高解析度的區域，例如分離後的清洗過程。

聚焦梯度通常比分段梯度更短、更誇張。一般而言，進樣後一開始的溶劑強度非常低。之後會迅速增加到低於洗脫相關化合物所需的溶劑比例2–5%之間（即22%洗脫濃度 – 2% = 20%開始平緩梯度）。接著繼續運作平緩梯度，斜率大約為在快速偵察分離中所確定斜率的1/5，最後在高出相關化合物洗脫濃度的2-5%之間結束（即22% + 2% = 24%停止平緩梯度）。最後，溶劑百分比迅速增加，可清洗管柱上任何殘留的樣品成分。

開發聚焦梯度

使用快速偵察梯度分析樣品後，可用以下計算為相關化合物開發聚焦梯度。每個方程式後面都有一個理論範例。

首先，必須測定偵察梯度運作所用儀器的系統滯留體積。如需滯留體積測定說明，請見本入門讀本中的〈滯留體積測定〉一節，也可參閱「分析級到製備級梯度的換算」應用程式工具，獲取網站：www.waters.com/prepcalculator

此外，也要測定偵察運作所用管柱的管柱體積。使用圓柱體體積V = πr²h並補償填充材料佔用體積即可計算，即V = πr²h (66%)。「分析級到製備級梯度的換算」應用程式工具也可用來計算。

方程式1：管柱體積

管柱體積 = π r² x 長度 x 66%（可用於移動相的比例）/1000（將mm³轉換為mL）

範例：

CV = 3.14 x (4.6 mm/2)² x 50 mm x 0.66/1000
CV = 548 mm³ = 0.548 mL

方程式2：梯度形成和偵測器之間的補償體積

補償體積 = 系統體積* + 管柱體積
*系統體積或滯留體積

範例：

補償體積 = 1.04 mL + 0.548 mL
補償體積 = 1.588 mL

方程式3：到達偵測器的時間

到達偵測器的時間 = 補償體積(mL)/流速(mL/min)

範例：

到達偵測器的時間 = 1.588 mL/1.5 mL/min
到達偵測器的時間 = 1.06 min

方程式4：形成洗脫濃度的時間

形成洗脫濃度的時間 = 目標波峰滯留時間 – 到達偵測器的時間 – 梯度保持時間

範例：

形成洗脫濃度的時間 = 6.0 min – 1.06 min – 0.0 min
形成洗脫濃度的時間 = 4.94 min

方程式5：洗脫濃度百分比

%洗脫濃度 = 形成洗脫濃度的時間/偵察梯度段時長 x 偵察梯度變化 + 初始偵察梯度%

範例：

%洗脫濃度 = 4.94 min/6.0 min x 90% + 5%
%洗脫濃度 = 79.1%

方程式6：管柱體積(CV)數量

管柱體積數 = 1管柱體積/mL x 流速(mL/min) x 偵察梯度段時長

範例：

# CV = 1 CV/0.548 mL x 1.5 mL/min x 6 min
# CV = 16.4

方程式7：偵察梯度斜率

偵察梯度斜率 = %偵察梯度變化/管柱體積數

範例：

偵察梯度斜率 = (95% – 5%)/16.4 CV
偵察梯度斜率 = 5.49%/CV

方程式8：聚焦梯度斜率

聚焦梯度斜率 = 1/5 x 偵察梯度斜率

範例：

聚焦梯度斜率 = 1/5 x 5.49%/CV
聚焦梯度斜率 = 1.1%/CV

從低於估計洗脫百分比5%到高於估計洗脫百分比3–5%來建立聚焦梯度段。例如，洗脫百分比為79%。

方程式9：聚焦梯度段的時間長度

聚焦梯度段的時間長度 = %範圍 x (1/偵察梯度斜率) x 管柱體積 x (1/流速)

範例：

聚焦梯度段的時間長度 = (79%+5%) - (79%-5%) x (1/1.1%) x (0.548 mL) x (1/1.5 mL/min)
聚焦梯度段的時間長度 = 3.32 min

最後一步是使用上述方程式計算出的值來建立聚焦梯度。