製備級液相層析入門讀本

開發出一種分離方法並將其升級到所需的規模後，最後一步就是分離或收集相關化合物。操作員可以在監測波峰洗脫時手動收集餾分，或者根據偵測器訊號或滯留時間自動收集餾分。

餾分延遲時間

當偵測器偵測到的波峰符合使用者定義的收集觸發標準時，就會進行餾分收集。當波峰出現在偵測器中時，表示還沒有到達餾分收集器。如果太早觸發餾分收集器，餾分收集器就會錯過波峰。請務必事先測定系統特定的餾分延遲時間，才能正確為餾分收集計時。其中一種校正方法是注入濃縮染料，然後對照偵測器偵測到的時間與到達餾分收集器所需的時間。餾分延遲時間校正通常是一次性的過程，輸入軟體之後，就可以針對任何流速重新計算。從偵測器到餾分收集器的流路若有什麼變化，例如加入分流器，就必須重新校正餾分延遲時間。

手動餾分收集

手動收集相當直接了當。使用者觸發餾分收集器上的切換閥開關，同時透過線上型儀器軟體即時訊號圖，監測化合物圖形的洗脫情形。手動餾分收集可以發揮充分的靈活性，只要收集純化運作所需的部分即可，但由於缺乏自動化，所以通量往往很低。

波峰型餾分收集

波峰型觸發是一種根據偵測器訊號自動收集餾分的方法。層析圖中決定波峰是否應觸發餾分收集器的參數，通常是指波峰高度、閾值和/或斜率。

波峰型餾分收集最常用的方法是以高度或閾值為依據。一旦訊號達到預定義的偵測器高度，就會觸發餾分收集。當訊號低於預定高度時，則停止收集。

按斜率收集餾分通常是更有難度的收集方法，但可以收集到沒有基線分離的波峰。按斜率收集時，軟體會在層析圖沿一階導數偵測到的數學拐點處，自動觸發餾分收集。

按質量偵測收集餾分

在以質量為依據的餾分收集中，只會收集使用者定義所需質量的化合物。因此，按質量收集可能比波峰型收集更為有效。質量型餾分收集的大致要求如下：

• 化合物的分子質量必須為已知。
• 化合物必須為游離狀態才能進行質量偵測。

餾分分析

收集餾分之後，就可以直接在收集容器中開始分析，或者去除溶劑以產生純化產物。旋轉蒸發器可以用來將餾分乾燥。使用時，樣品中的溶劑會蒸發掉，而水份則會冷凍乾燥。如果使用了無機緩衝液，或如果水份特別多，可讓餾分流經逆相SPE匣式萃取匣，即可捕獲目標化合物（這個過程也稱為脫鹽）。然後以少量有機溶劑洗脫所捕獲的化合物，就能更容易蒸發掉有機溶劑。

回收率估計值可透過使用各種例行分析技術的餾分分析來測定，例如：UV、IR、MS、NMR、X射線、實驗和/或結構解析。在有標準品的情況下，可以直接比較分離物與文獻數據，但是如果目標化合物不明，就需要有各種物理、化學和光譜技術的全方位綜合系統方法，才能制定出純度和穩定性概況。

方程式14：回收率百分比

在分析分離物時，如果純度、回收率或活性不符合預期，請針對以下情況評估分離物：

• 直接從收集容器中試驗時，會形成濃度梯度。因此，純度結果取決於收集容器中萃取樣品的位置。在分析之前應充分混合樣品，才能得出具代表性的結果。
• 如果樣品容易在DMSO等強溶劑中溶解，但在移動相中不易溶解，那麼收集的餾分會因為長時間儲存在收集容器中而結晶。如果是萃取液相來進行純度和濃度分析，結果只能代表可溶的部分。
• 活性化合物也可能由於收集時間、純度試驗和活性試驗之間的分解作用而損失。在乾燥過程中也有可能產生分解作用。因此，活性試驗幾乎都在乾燥前後進行。
• 活性化合物已滯留在管柱上。
• 活性化合物在分離過程中使用的條件不太穩定。
• 萃取的溶液可能不是在與移動相相容的溶劑中製備，因此可能會有沉澱現象。
• 大多數活性化合物分散在各式各樣的餾分中，導致餾分中有無法偵測的化合物量。
• 萃取物的活性可能會因為原態樣品中有其他化合物，因此沒有個別的活性。
• 如果分離物是在相鄰洗脫不純物無法吸收的紫外線波長下進行收集，那麼其純度可能會不如預期。

如果分離物不在應用的純度、通量或回收率要求範圍內，可以使用相同的分離方法對分離物進行再純化，或者可開發不同管柱選擇性的全新整體分離方法。層析分離人員可以決定要投入純化的時間和精力，以滿足所需的純度、通量和回收率目標。