製備級液相層析入門讀本

方法升級

當分離物的潛在價值獲得初步證明時，可以「升級」分離方法，產生更多分離物，方便進一步評估。小規模的分離屬性，例如解析度等，在大規模上也能輕易保持不變。不過一定要修改流速、樣品上樣量和系統硬體，才能透過定義的數學方程式，將分離方法有效地轉移到更高容量的管柱。

第一階段升級通常包括，生產幾毫克到幾克的分離物，供各種用途使用，例如早期生物學評估，以及透過治療特性改善建立產物類似物的結構活性關係。進一步升級階段則需要100克到數公斤，甚至更大量的材料，用於臨床前和臨床開發，成功的話，最終可達到全規模生產。在這種規模下，優良藥品製造規範(cGMP)等文件和品質控制的措施，就開始派上用場。

純化規模	目標量	典型應用
分析級微純化	µg	分離小規模新藥開發實驗所使用的酶或化合物
半製備級	mg	小規模生物試驗，代謝物的結構解析和表徵分析
製備級	g	分析級參考標準品，毒物學偵察研究
製程	kg	工業規模藥物和活性化合物製造

表3.層析分離規模、目標量和相關應用。

升級工作流程是逐步的過程。升級計算必須準確執行，否則最終結果可能無法提供在小規模分離中達到的解析度。為了提高方法升級的成功率，保持滯留時間和選擇性，需要仔細考慮幾個要求：

小規模和大規模都必須使用相同的移動相。
使用相同充填材料、長度和粒徑大小的管柱可以輕鬆升級（或者，只要保持初始方法的L/dp、管柱長度與粒徑比率不變，就可以變更粒徑大小）。
樣品要在相同稀釋劑中製備成相同濃度。

圖13.升級工作流程。

滯留體積測定

升級或更換系統時，滯留體積（延遲體積、系統體積）可以保持早期洗脫波峰的波峰解析度，其定義為從梯度形成點到管柱頭的體積。若是高壓混合LC系統，這個體積主要包括混合器、連接管和自動進樣器試樣環的體積。低壓混合系統會將幫浦上游的溶劑混合在一起，因此額外的管路加上幫浦頭（或多個幫浦頭）的體積，再加上混合器、連接管和自動進樣環的體積，就是總滯留體積。

圖14.圈選（虛線）處是納入滯留體積的純化流路組件。

當移動相成分在管線上混合以進行等度分離時，滯留體積依然存在，但由於移動相濃度不變，因此層析分離中沒有觀察到差異。另一方面，梯度方法仰賴移動相濃度隨時間的變化來產生波峰分離。梯度方法中會補償滯留體積，確保波峰滯留時間維持不變，若目的是收集純化餾分的話，這點就特別重要。

若要測定滯留體積，可使用移動相A和移動相B溶劑的階段式梯度，其中含有不同紫外線吸光度的添加劑，例如0.05 mg/mL尿嘧啶，或0.2%丙酮的乙腈溶液），這是根據www.waters.com/prepcalculator「分析級到製備級梯度的換算」所述的方法。

1. 取出管柱。

2. 使用乙腈作為移動相A，乙腈和添加劑（0.05 mg/mL尿嘧啶，或0.2%丙酮）作為移動相B。

3. 將紫外偵測器設定為254 nm。

4. 計算滯留體積兩次（即，計算原始儀器中流速的滯留體積，以及目標儀器中預期流速的滯留體積。）

5. 在100% A的條件下收集基線達5分鐘。

6. 將階段變化設為5分鐘後轉成100% B，然後再收集5分鐘的數據。

7. 量測100% A和100% B之間的吸光度差異。

8. 在吸光度差的50%處量測時間。

9. 計算階段開始與50%點之間的時間差。

10. 將時間差乘以流速。

表4.測定滯留體積的程序。

容量

在純化層析中，最主要是讓收集的化合物保持足夠的解析度。管柱容量（或上樣量）由化合物和相鄰波峰的解析度來衡量。雖然管柱容量主要受管柱長度和直徑的影響，但樣品混合物的溶解度和複雜性等其他因素也會有所影響。容量趨勢如下：

容量主要取決於特定樣品的溶解度。
簡易混合物的容量更高。
在需要高解析度的條件下，容量較低。
容量取決於上樣條件。

			直徑(mm)
長度(mm)	4.6	10	19	30	50
50	3	15	45	110	310
75	?	?	?	165	?
100	5	25	90	225	620
150	8	40	135	335	930
250	13	60	225	560	1550

合理流速(mL/min)	1.4	6.6	24	60	164
合理注射量(µL)	20	100	350	880	2450

表5.常用製備級管柱尺寸的預計上樣量(mg)。範例：若是4.6 x 50 mm管柱，預計上樣量為每20 µL進樣3 mg。

在方法升級之前，透過上樣研究來測定特定相關化合物的容量。這些研究以小規模進行，並透過以下其中一種技術來執行：製備高濃度樣品並逐漸增加注射量，或者製備多種濃度的樣品而注射量保持不變。不論是哪一種技術，目標都是測定最大濃度或注射量，以便讓相關化合物與周圍不純物充分分離開來。測定管柱容量之後，就可以使用更大直徑管柱和工作流程的方程式來升級方法。

圖15.上樣量研究。請注意，帶有星號的波峰上樣增加，解析度會降低。

方程式10：濃度上樣升級

因此，要將4.6 mm x 50 mm分析級管柱上的1800 µg (1.8 mg)上樣量升級到19 mm x 50 mm製備級管柱上的等效上樣量：

方程式11：注射量升級

升級20 µL注射量上樣：

管柱內稀釋

強溶劑（例如DMSO）可以提高樣品溶解度，因而有可能增加管柱容量。可惜大量進樣強溶劑會讓層析分離變形，導致能成功分離的產物數量減少，而非增加。

當強溶劑作為夾在水性溶劑流中的充填劑，從進樣器帶往管柱頭時，就會發生變形。充填劑邊緣可能會發生樣品沉澱現象，其中強樣品溶劑會被水性溶劑稀釋。這種沉澱會造成流體路徑堵塞，導致高壓系統關閉。

圖16.使用管柱內的移動相稀釋樣品充填劑。如果是在強稀釋劑中製備樣品，那麼當樣品通過含有水性移動相的管柱時，樣品充填劑的邊緣就可能會發生沉澱現象。

如果沉澱不會導致系統關閉，那麼樣品就會進入管柱，但是要等到樣品充填劑以移動相稀釋之後，樣品才會滯留。注射量較大的話，只有讓充填劑沿管柱移動很長的距離，才能得出稀釋樣品所需的體積。如此一來，樣品會沉澱為佔據管柱大部分體積的譜帶。結果，散布在大量沖提液中的波峰的解析度就會不完整。可以嚴格限制進樣樣品的體積和質量，減少這種情況發生。

另一種方法是，使用水或弱溶劑大量稀釋樣品，確保滯留性充足。

圖17.樣品在強溶劑中進樣的傳統方法。樣品充填劑會隨著管柱移動而稀釋，導致波峰變形。

這兩種方法都不能令人完全滿意，因為通量和回收率也會受到影響。或者，在管柱內稀釋系統中，將系統重新配置，將樣品充填劑帶往管柱入口，然後由水相稀釋劑流連續稀釋。轉移至管柱的速度之快，因此不會發生沉澱現象。然後樣品分子會吸附到填充材料上，形成非常窄的譜帶，洗脫成解析良好的小體積波峰。由於樣品在試樣環或管柱頭的沉澱能力有限，因此使用管柱內稀釋可提高系統的耐用性。

提高樣品成分波峰之間的解析度，可以增加樣品量，減少分離所需的進樣次數。在實踐中，使用管柱內稀釋時，管柱上樣量通常可以增加3-5倍。高壓停機的發生率降低，管柱使用壽命延長。

圖18.管柱內稀釋系統。樣品充填劑被帶往管柱入口，由水相稀釋劑流連續稀釋，沒有沉澱現象。樣品譜帶洗脫成解析良好的小體積波峰。

圖19.使用傳統進樣和管柱內稀釋進樣，以強溶劑溶解樣品的比較。在管柱上進樣1000 µL相當於133 mg。

流速升級

為了在升級過程中成功保有分離品質，小規模管柱和大規模管柱之間的線性速度必須保持不變，這樣流速才會在相同長度、粒徑大小和填充材料的大規模與小規模管柱之間，達到不錯的升級效果。流速升級時，必須考慮系統硬體的功能，例如幫浦流量上限和背壓上限。如果硬體不符合流量要求，應考慮換成適當的儀器來因應規模所需。

方程式12：流速升級

例如，如果分析級管柱(5 µm, 4.6 mm x 50 mm)的流速為1.5 mL/min，則製備級管柱(5 µm, 19 mm x 50 mm)的流速計算為：

梯度持續時間升級

一般而言，如果調整流速來保持移動相的線性速度，那麼升級過程中就不需要梯度變化。如果管柱長度不同，就必須計算梯度時間，以保持在小規模得出的分離和滯留時間。

方程式13：梯度時間升級

例如，在50 mm分析級管柱上持續5分鐘的線性梯度分段，會在100 mm製備級管柱上持續10分鐘：

製備級管柱換算程式

質量、流量和梯度升級計算也可以在Prep OBD管柱換算程式中進行。這個換算程式是簡單好用的應用程式，能協助計算所有分析級到製備級的升級情形，包括上樣量、系統體積、流速、溶劑體積消耗、質譜儀導向層析的分流比，以及聚焦梯度UPLC方法轉移到製備級方法。請造訪www.waters.com/prepcalculator或透過Waters純化軟體（例如ChromScope）取得該應用程式。