製備級液相層析入門讀本

如果等度分離或聚焦梯度無法充分解析相關化合物，可以透過變更溶劑、pH值、固定相和/或溫度來重新開發分離方法。這類修改會對分離產生很大影響，因此在做完任何變更之後，必須執行偵察梯度和方法最佳化。

溶劑

HPLC移動相由弱溶劑、強溶劑和修飾劑三種成分組成。溶劑必須具有高純度、可用於偵測器、不會與樣品反應，而且黏度低，才能讓系統背壓維持在低水平。

在逆相層析中，弱溶劑幾乎都會是水，而乙腈和/或甲醇因為黏度低、強度高，且在低波長範圍內有利於紫外線偵測，所以通常當作強溶劑使用。此外，乙腈和甲醇還能提供不錯的峰型，分離後容易蒸發，而且不會與大多數樣品反應。

與層析分離法使用的任何溶劑一樣，在樣品分析過程中，偵測波長一定要保持高於所報告的溶劑紫外線截止值。若低於此值，偵測器會將溶劑組成的變化記錄成基線漂移或其他層析干擾。

視分離所用的強溶劑而定，分離過程和波峰順序可能會有所不同。事先很難知道什麼溶劑能讓相關化合物發揮最佳解析度，因此，通常要經過反複試驗才能確定選擇什麼強溶劑。不過可以透過混合不同的強溶劑（例如50:50乙腈/甲醇），來達到所需的洗脫順序或解析度。

pH值

移動相pH值是一個很重要的變數，能控制逆相分離的滯留性。化合物通常含有一或多個酸性或鹼性官能基，因此大多數逆相移動相都需要控制pH值。

當酸的pH值高於或低於其pK_a值的2個以上pH單位時，超過99%的酸會分別處於游離或非游離狀態。反之，當鹼的pH值低於其pK_a時處於游離狀態；高於其pK_a時處於非游離狀態。非游離形式的極性較弱（疏水性更強），因此會更強烈地滯留在逆相系統中。所以，酸在pH值低的條件下滯留性更好，鹼在pH值高的條件下滯留性更好。

如果移動相pH值接近相關化合物的pK_a，那麼pH值只要有些微變化，都會讓滯留性發生很大變化，直接影響分離的穩定性。移動相的pH值可由添加緩衝液來控制。添加少量酸或鹼後，緩衝液就能維持pH值。緩衝液在其pK_a的±1個pH單位範圍內使用最有效，不過有的緩衝液在其pK_a的±2個pH單位範圍內也能充分發揮緩衝能力。

選擇有效的pH值時，也要考慮管柱的穩定性。

矽膠管柱在pH 2和pH 8之間的運作效果佳。鍵結相在pH值低的情況下易於水解，而在pH值高的情況下，矽膠骨架會變得越來越容易溶解。pH值高於8時，需要使用非矽膠基質顆粒或專為高pH值穩定性設計配位基的顆粒。管柱包裝說明書上會說明pH限制和一般處理建議，也可造訪管柱製造商的網站查詢。

若要使用層析分離方法進行純化，那麼用來調節pH值的緩衝液添加劑必須有足夠的揮發性，才能從純化的分離物中去除。此外，使用揮發性添加劑時，必須注意不要讓MS離子源遭到污染或發生沉澱現象。甲酸、乙酸和醋酸銨等常用的添加劑在移動相中以0.05–0.1%的濃度溶解時效果佳。磷酸鹽是液相層析分離中最受歡迎的緩衝液添加劑，但不建議用於純化或MS應用。

緩衝液濃度建議為5–10 mM。使用緩衝液時，務必在製備後過濾，幫浦管不使用時要沖洗乾淨，防止管線內沉澱，還要定期更換溶液以防細菌滋生。

固定相

管柱固定相對分離的影響很大。逆相管柱的固定相範圍為C₁₈到C₈，或者可以含有工程配位基，提高選擇性和分離能力。許多實驗室的管柱庫存有限，因此當溶劑和pH值無法提供足夠的解析度時，更換固定相往往是最後的辦法。Waters逆相管柱選擇性圖表(www.waters.com)提供不同管柱固定相製造商的選擇性比較。這個圖表工具在早期方法開發階段非常有用，方便比較管柱的選擇性。

長度

管柱長度會影響分離效能。各種長度的管柱，包括25 mm、50 mm、100 mm、150 mm和250 mm，都可購買得到。

若管柱較短，孔盤數會比較少，但有利於快速分離；若管柱較長，孔盤數會較多，滯留時間會更長。管柱越長，背壓就會越大、運作時間越久、溶劑消耗更多，且成本增加，所以解析度充足且越短的管柱，就是理想選擇。

粒徑大小

當樣品通過填充材料時，管柱抵抗樣品譜帶分散或擴散的能力稱為「效率」。粒徑較小，效率越高，因為顆粒內的波峰分散度較低。效率高，峰寬就窄，分離能力也會更好。

製備級管柱粒徑通常為5–10 µm，而超高壓分析級分離則使用1.7–3.5 µm粒徑。雖然粒徑小能提高效率，但是管柱成本和系統背壓也會增加。因此，以高流速運作原態樣品混合物的大型製備級管柱，通常不提供粒徑小的選擇。

溫度

由於不同的溫度會影響選擇性，因此管柱加熱是最佳化特定樣品分離的一種非常方便的工具。移動相黏度和系統總壓力會隨著溫度升高而降低，讓系統、接頭和管柱的張力降低，最終提高運作的耐用性。溫度還能縮短滯留時間，改變分離的選擇性。很難從溫度變化知道波峰解析度會增加還是降低，因此這種用法只能針對各個特定的分離。

雖然在小規模層析分離中，溫度控制是常規做法，但溫度很少會當成是操作製備級層析分離的參數。首先，直徑大的管柱很難從外部均勻加熱。其次，大規模的高流速分離，傾向於保持進樣溶劑的溫度。電熱毯和管柱烘箱雖然對小規模分離來說即足夠，但卻不能在大管柱直徑之間均勻加熱。因此，管柱直徑上會形成溫度梯度，反而不利於層析分離。

如果需要溫度控制來保持樣品溶解度，可以在製備級管柱的管柱頭連接一段管路，並將其置於熱水浴中，來克服溫度梯度的問題。這段管路可充當預熱器，讓進樣溶劑維持在所需的溫度。作為日後升級的層析分離法，建議在室溫環境條件下進行，溫度控制只能當作最後的辦法。