製備級液相層析入門讀本

樣品進樣可以手動完成，但通量低，或者自動進樣，適合高通量應用。在手動進樣中，旋轉閥手柄可將裝有進樣環的Rheodyne閥取出流路。將過濾後的樣品吸入注射器，接著接上鈍的針尖，並去除氣泡。將針頭插入進樣口，然後將樣品分配到進樣環中。旋轉Rheodyne閥手柄，將進樣環放回流路。在這個位置，樣品會置於流路中。

樣品進樣也可以採自動化，實現高通量。大容量自動進樣器可以在一個平台上控制樣品抽吸和進樣的情形。在純化軟體中配置一個機械臂，可控制從微量孔盤、試管、閃爍計數瓶或傳統自動進樣器瓶中進樣樣品。

進樣環

一般會根據預期注射量多寡來選擇進樣環。若進樣環的體積太大，樣品可能會吸附到進樣環的多餘表面積上，導致延遲，或者可能出現樣品分散的現象，這兩種情況都不利於層析分離的品質。接近預期注射量的進樣環大小，能發揮充分的再現性和層析分離圖形。

餾分收集器

應用所需的通量，會決定餾分收集所需的自動化程度。餾分收集器包含一個開關和樣品切換閥。切換閥會在適當的時間打開，讓化合物在洗脫時可收集起來。

雖然餾分收集可以手動執行，符合低通量應用，但也可以自動執行，達到更高通量。自動化程度取決於所需餾分的數量和體積。高通量餾分收集器通常使用裝有採樣和餾分收集探針的機械臂，在同一個工作台上，同時進行樣品進樣和餾分收集。

收集容器

許多純化系統都能使用各種收集容器的形狀、尺寸和體積。最常見的收集容器包括，分配到大容器中的試管、小瓶、瓶子或漏斗。收集容器在接觸樣品和溶劑時需要潔淨乾燥，且為惰性。收集容器通常會置於容器收集層床上，頂端無封閉，以容納分配下來的分離物。

在某些收集系統中，不收集的餾分並不會直接成為廢液，而是進入特定樣品的廢液容器。如果使用者收集到的波峰有誤、運作的方法不當、未能偵測到目標或收集失敗而無法觸發，樣品就會流入特殊的廢液容器中，蒸發其中的溶劑，然後將樣品重新溶解再重新進樣。

偵測器

執行純化層析時，一定要特別注意偵測的問題。純化使用的四種主要偵測器類型分別是，紫外線/可見光、折射率(RI)、揮發光散射(ELS)和質譜(MS)。

偵測器能以使用者所設定的單一波長（紫外線/可見光），或者以光電二極體陣列(PDA)偵測器所收集波長範圍內的吸光度，進行偵測。在方法開發過程中，經常會使用PDA來為相關化合物選擇合適的波長。在可見光範圍內運作時，收集200–400 nm或更高（≥350 nm）的波長，即可完成選擇。讓相關化合物發出充分訊號強度的波長，就是分離的有效波長。同時也要測定相鄰洗脫不純物的有效波長。否則，一個波長上收集的「純分離物」，在不同波長下觀察時，可能還是含有不純物。發生這種情況時，可能需要展開第二次方法開發和純化，進一步純化分離物。

使用紫外線/可見光和PDA偵測器時，高靈敏度可能會是純化過程中常見的障礙，會讓大注射量和高樣品濃度受阻。因此，會採用短光程(1–3 mm)的偵測器流體槽，而不是長光程(10 mm)的分析流體槽。

折射率(RI)偵測器有利於偵測紫外線吸收力有限或為零的成分，例如酒精、糖、醣類、脂肪酸以及聚合物。RI偵測器會偵測折射率差異，測定出化合物是否存在。RI偵測器有時稱為「通用」偵測器，因為不需依賴游離或含有發色團的化合物。RI偵測器的缺點是，只能用於等度分離，避免偵測到造成基線漂移的梯度干擾。

ELS偵測器可當作紫外線/可見光和RI偵測器的替代方法。ELS偵測器的作用是，讓洗脫液流經加熱的霧化器來揮發分析物並蒸發溶劑。溶劑成為氣體而消散，但分析物會形成微顆粒流，經過光源和偵測器之間，並由偵測器散射光線和量測效果。ELS偵測器的主要優點是，能偵測不含發色團的化合物，並且可用於等度和梯度分離。但缺點是，ELS偵測器對樣品具有破壞性，因此偵測器不能與主流路串聯。流路必須分開，只讓一小部分進入ELS偵測器，其餘部分進入餾分收集器。

MS偵測器會根據質量和質譜儀來鑑定從管柱中分離出來的樣品化合物。MS是靈敏度佳和選擇性高的分子分析方法之一，可提供分析物分子的分子量和碎斷模式等資訊，有益於確認分析物的身分。配備不同類型介面的各種MS系統都適用。最受歡迎的介面是電噴灑(ESI)和大氣壓化學游離(APCI)。每個介面與不同領域的適用性、流速能力、靈敏度和訊號值線性都有關聯。MS跟ELS偵測器一樣，是一種破壞性技術，因此必須分流，讓一小部分進入偵測器，而主要部分則進入餾分收集器。

分流器

若是有化學破壞性的偵測器，例如MS或ELS，必須將來自管柱的一部分流量從主流量中分離開來，然後進入偵測器進行餾分觸發。由於偵測器必須在餾分收集器觸發（延遲時間）之前偵測到一個波峰，因此分流必須先抵達偵測器，才能讓主流量到達餾分收集器。為此，可以使用「補充幫浦」和「補充溶劑」來增加分流的速度。

分流器可以分為「被動式」或「主動式」。被動和主動分流器在對主要樣品流進行採樣時同樣有效，因此所採用的分流器類型取決於使用者偏好。

被動分流器會使用限制管路，例如延遲線圈和「T型接頭」，保持特定的流速範圍和分流比。

主動分流器有兩個完全分開的流路和一個快速切換閥，這個切換閥會將一部分主流量轉移到補充流量中，並在其中以預定的分流比加以稀釋。

管路

在決定流體路徑要使用什麼合適的管路時，必須考慮幾個因素。首先，要確認系統流路管路的完整性，這多半取決於管路製造材料和應用方面的適用性。管路可以由PEEK（聚醚醚酮）高效能工程聚合物或不銹鋼製成，並且應與樣品和移動相的化學性相容，防止樣品黏在管路表面，導致樣品損失，產量低或發生殘留效應。

系統管路也要能承受流路的壓力和運作溫度，雖然採用純化層析時，通常不會使用流體路徑的溫度控制，所以不會是個大問題。

在考慮壓力限制時，層析純化系統可分為三個區域，分別是儲液瓶和幫浦之間的「低壓」區、幫浦和管柱進樣端之間的「高壓」區、管柱出口和偵測器後面廢液池或餾分收集器之間的第二個「低壓」區。每個區域的管路都有獨特的壓力保持要求。在要求嚴格的壓力區選擇不合適的管路材料，不僅會導致效能不彰和層析分離問題，還會造成洩漏和破裂。

有兩個變數要特別注意，那就是管柱內徑和管柱長度。一般來說，內徑越小，內部速度越快，樣品分散度越小，可讓樣品保持在濃縮狀態。可是，管路內徑變小，管路產生的壓力也會顯著增加，可能會導致系統背壓無法與偵測器流體槽或其他系統組件相容。連接不同內徑的管路長度時，接頭處或附近會形成無效體積。這種無效體積會導致峰型出現問題和殘留效應，因為流體或移動相無法充分將其一掃而空。

考慮管路長度時，產生的流路體積越大，樣品在移動相中稀釋的機會就越大，分離成分重新合併在一起的機會也越大。管路長度也會影響系統壓力、延遲體積和管柱外體積。

大規模製備級純化系統通常以高流速運作。若要緩和由這些流速引起的背壓，一定要使用適當直徑的管路來連接純化系統，確保層析分離有個好結果。您可以選擇一系列管路直徑，流速範圍為0.05 mL/min至130 mL/min。