製備級液相層析入門讀本
製備級液相層析(LC)簡介
層析分離是指根據混合物各成分的化學屬性將其分離的一種方法。製備級(Prep)層析或純化層析是指使用層析法來分離出一定數量達到足夠純度的化合物用於進一步實驗或程序的過程。科學家首先確定相關化合物，接著開發一種方法，將該化合物與原料、副反應或其他不純物成功分離開來。整體目標是為了滿足高通量和分析效率日益增長的需求，同時調整純化技術，以滿足適當的規模、純度和再現性要求。
從大型製藥組織到小型天然物研究小組，許多科學環境都會使用純化層析法。雖然應用領域可能不同，但一般使用者要求卻非常相似，都希望目標分離的最終純度能夠達到95%以上。
本入門讀本旨在為液相層析分離人員介紹快速擴展的LC純化領域，包括層析分離方法的開發、方法升級所需的數學方程式，以及餾分收集的常用模式等基本原理。逆相就是本書探討的主要分離模式，因為大多數製備級LC應用都會使用該模式。
採用液相層析法進行純化
LC純化系統的設定與一般液相層析系統的設定相同，只是多了餾分收集器。將樣品混合物注入層析分離管柱，並根據特定的化學或物理特性來分離其中的成分。這些成分被偵測到後，有可能會轉移到廢液，或收集起來供進一步實驗使用。收集洗脫液的過程可以由分析人員在成分洗脫時簡單地手動收集，也可以全自動進行，自動收集時，偵測器會向餾分收集器發出訊號，將流量轉到收集容器中。轉到收集容器中的分離餾分，其純度取決於該化合物與分離過程中其他相鄰洗脫之不純物的解析度。
圖1.製備級LC系統。
純化分離的成敗取決於所得出分離物的通量、回收率和純度。純化分離是由波峰分離或「解析度」所驅動。以下層析分離參數對解析度最有影響力：
- 管柱填充材料（固定相）
- 溶劑強度
執行方法開發工作流程，確定出能提供充分解析度的條件。這個工作流程非常簡單，只是需要採取多個步驟，這些步驟的複雜性和必要性取決於每個樣品的獨特屬性。無論樣品分離的應用或模式（即逆相、離子交換等）為何，工作流程通常都是一樣的。
圖2.一般製備級工作流程。
在設計工作流程之前，一定要考慮到的因素是目標化合物的性質。如果是從同一來源或新來源中分離已知化合物，則很容易獲得目標化合物層析分離行為的文獻資訊，也能輕鬆從先前發表的方法中選擇合適的分離方法。可若是化合物類型不明的粗萃物，設計分離的實驗步驟就會比較困難。為此，可以在初步分離後進行一系列探索性實驗，深入瞭解相關化合物的資訊，例如pKa、分子量、溶解度、穩定性、紫外線光譜和生物活性。然後依據這些資訊修改初始的分離方法，以便符合化合物的化學和物理性質要求。這些資訊不僅有助於方法開發，對於掌握分離產物在收集到之後的穩定性也非常重要。
第一步是製備樣品，並使用快速偵察梯度進行一般分離。這一步通常是小規模分離，目的是節省珍貴的樣品材料。根據這步分離的結果，可以計算出洗脫相關化合物的溶劑條件，並且進一步最佳化分離條件，達到充分的解析度。同時還能進行上樣研究，測定出能保持充足解析度以產生高純度分離物的上樣量。
確定分離方法和所需的上樣量後，通常會對有應用前景或潛在價值的分離物進行方法升級（但不是必須執行）。本入門讀本中「規模」(scale)一詞是指，符合產品純度、通量和產量等應用目標所需的儀器和方法。方法「升級」(scaled-up)後，會轉移到適合處理更高上樣量的硬體系統中。基本上，升級方法就是透過一系列升級計算和硬體改動，在保持解析度的同時，從分析級直徑管柱變成製備級直徑管柱的過程。
圖3.分析級和製備級純化的管柱內徑比較。
樣品
可從中分離出特定化合物的樣品來源廣泛，包括藥物中間體、天然物、營養品、飲料或工業產品。只要是可以用液體基質萃取並溶解的材料，就可以使用層析法來純化個別成分。
樣品萃取使用的技術取決於所萃取材料的複雜性。若是天然物，通常可將樣品乾燥並研磨成微細顆粒，提高萃取效率。然後採用滲濾（樣品量大）或者浸漬（樣品量小）技術來萃取相關化合物。這兩種技術都要在樣品材料中加入溶劑，並在音振、渦漩或浸泡後收集溶質。收集萃取物後，與所有HPLC樣品一樣，必須先過濾再進樣，以便去除微粒和氣泡。
分離模式
製備級層析主要有四種分離模式：逆相、正相、凝膠滲透和離子交換。分離模式適合與否，取決於固定相和溶劑與所分析之樣品、萃取物或混合物的相容性。
逆相層析是純化方法開發中最常用的技術，其固定相的極性弱於洗脫溶劑的極性。逆相層析採用的沖提液是水和乙腈或甲醇的混合物，同時加入緩衝液（酸性或鹼性）來控制樣品游離程度，並佔據固定相中未反應的游離矽烷醇基。矽膠基質固定相中的鍵結相材料或吸附劑使用烷基化試劑進行了衍生化處理，能減少波峰拖尾現象，並提高層析分離的再現性。這些衍生化試劑處理（矽烷化）以及碳載量程度能讓不同製造商的管柱發揮獨特的分離特性。
快速開始方法開發
建立逆相分離方法時，通常會選擇小規模的分析級管柱（直徑≤4.6mm），但長度和填充材料直徑要能用於大規模（直徑≥10mm），以便日後升級使用。方法開發的關鍵是，找出正確的溶劑體系，以利發揮充分的分離效果。若是酸性化合物，一般會在酸性pH條件下製備水性移動相，同時製備甲醇或乙腈作為強溶劑。濃度為0.1%的甲酸是一種常用的緩衝液添加劑，因為它能與紫外線和質譜偵測相容。MS相容性有助於鑑定不明化合物，並製備出純化的分離物供進一步研究。要讓鹼性分子保持非游離形式，可以使用pH值為鹼性的移動相，不能使用pH值為酸性的移動相。在使用任何pH值的緩衝液之前，應查詢管柱固定相包裝說明書瞭解相容性。
水性移動相通常會置於幫浦位置A，強溶劑置於幫浦位置B。本入門讀本整篇都會用到「A」和「B」，分別指幫浦表中的水性溶劑和強溶劑。
