분취용 액체 크로마토그래피 입문서

1. Prep 150 LC 시스템을 사용한 항산화제 분리.
2. Prep 150 LC 시스템을 사용한 펩타이드 분리.
3. Prep150 LC 시스템을 사용하여 대마유에서 칸나비노이드 정제.
4. Waters Prep 150 LC 시스템을 사용하여 은행잎에서 플라보노이드 분리.
5. Prep 150 LC를 사용하여 에키네시아 추출물로부터 천연물 분리.
6. 질량 유도 AutoPurification을 사용하여 UPLC-분취 크로마토그래피로 화합물 분리를 보다 간편하게 자동화.
7. ACQUITY QDa 검출기를 사용한 합성 펩타이드의 질량 유도 분리.
8. 분취용 크로마토그래피에서 대용량의 손쉬운 분석법 개발을 사용하여 분리를 개선하기 위한 전략.
9. 분취용 액체 크로마토그래피에서 대용량 로딩의 효율성을 개선하기 위한 기술.
10. ACQUITY QDa 검출기를 통해 항생물질 혼합물에서 술파제 함유 화합물을 질량 유도 방식으로 분리.
11. ACQUITY QDa 검출기와 AutoPurify를 사용하여 질량에 의한 제약 합성물 분리.
12. ACQUITY QDa 검출기를 통해 분취용 크로마토그래피 혼합 표준물질에서 화합물을 분석하고 분리하기 위한 일반 조건.
13. UV 기반 오픈 액세스 워크업 정제 전략을 활용한 천연 제품 추출물의 예비 크로마토그래피.
14. 칡 추출물에서 푸에라린을 분리하기 위한 모듈식 분취용 HPLC 시스템.
15. 페퍼민트 추출물에서 미량 성분을 분리하기 위한 분취용 액체 크로마토그래피에서 분리능과 컬럼 로딩의 체계적 개선.
16. ACQUITY UPLC H-Class 및 Waters Fraction Manager Analytic 시스템을 사용한 소규모 펩타이드 및 불순물 분리.
17. ACQUITY H-Class 및 Waters Fraction Manager-Analyticalc 시스템을 사용한 복잡한 천연 제품 추출물의 소규모 구성 성분 정제.
18. At-Column-Dilution, 응용 자료, 개정 버전 A, Waters Corp, 2003. 유용한 응용 자료 및 참고 자료에 대한 자세한 내용은 www.waters.com을 방문하여 위의 파란색 참조 번호를 검색 창에 입력하십시오.  

결론: 

• At-Column-Dilution – 샘플을 컬럼 헤드에서 강용매로 희석하여 질량 용량을 높이고, 분리능을 향상시키며, 컬럼 수명을 늘리고, LC 시스템 견고성을 향상시키는 Waters 고유의 주입 기술입니다. 크로마토그램 - 검출기 반응 또는 용리액 부피 또는 시간에 대한 용리액의 분석물 농도에 대한 척도로 사용되는 기타 측정량에 대한 그래픽 또는 기타 표현입니다. 컬럼 부피(V_c), V_c = π x (r)² x 높이 x 66%(이동상에 사용 가능) / 1000(mm³를 mL로 변환하기 위해) – 검출기를 향한 흐름의 작은 부분에서 충전을 포함하는 튜브 부분의 형상 부피(튜브의 내부 단면적에 충전 베드 길이 L을 곱함; 보정을 위해 충전제가 차지하는 공간 66% 고려)이며, 주요 부분은 분획 분취기(Fraction Collector)로 이동합니다. 드웰부피(dwell volume)가 여전히 존재하지만 이동상 농도가 일정하기 때문에 서로 다른 드웰부피(dwell volume) 시스템에서 실행되는 크로마토그램 사이에 관찰되는 차이는 없습니다. 용출액, 용리액, 용리 – 용출액은 용액의 분석물을 포함하여 컬럼 배출구에서 나오거나 용리되는 용리액의 일부를 나타냅니다. 분석용 HPLC에서는 검출기를 통해 용출액에 들어 있는 분석물의 농도 또는 질량을 검사합니다. 분취용 HPLC에서는 일정한 시간 또는 부피 간격으로 연속적으로 분취량에서 용출액을 채취하거나, 검출기에서 관심 피크가 나타났다는 징후가 감지될 때만 불연속적으로 수집합니다. 이러한 분취물은 이후 처리를 거쳐 정제된 화합물로 얻어집니다. 소수성 – 물보다 유기 용매에 더 잘 용해되는 비극성 라디칼 또는 분자의 성질을 나타냅니다. 이온 교환 크로마토그래피 – 이온 교환 크로마토그래피(또는 이온 크로마토그래피)는 이온 교환기에 대한 친화도에 따라 이온과 극성 분자를 분리하는 크로마토그래피입니다. 큰 단백질, 작은 뉴클레오티드 및 아미노산과 같은 모든 유형의 하전 분자에 대해 이용되는 분리 기법입니다. 등용매 – 크로마토그래피 분리 과정에서 이동상 조성이 일정하게 유지됩니다. 메이크업 용매 – 질량 유도 정제 시스템에서 분취 흐름의 샘플 분할을 희석하여 검출기로 전달하는 데 사용되는 용매입니다. 이동상 – HPLC 컬럼에서 화합물을 용리시키는 데 사용되는 용매입니다. 유량 – 단위 시간에 컬럼을 통과하는 이동상의 부피입니다. 주입기(Autosampler, Sample Manager) – 미리 정해진 양의 샘플 용액을 유동 이동상 흐름에 정확하고 정밀하게 도입(주입)하기 위한 메커니즘입니다. 등용매 용리 – 이동상의 조성이 용리 과정에서 일정하게 유지됩니다. 이동상 – 고정상 흡착 베드의 길이를 따라 일정한 방향으로 흐르는 유체입니다. 피크 – 단일 성분이 컬럼에서 용리되는 동안 검출기 반응을 기록한 것입니다. 분리능(Rs) – 해당 머무름 시간의 차이로 표시되는 두 피크의 분리를 베이스라인에서의 평균 피크 너비로 나눈 값입니다. R_s = 1.25는 너비가 동일한 두 개의 피크가 베이스라인에서 분리되었음을 나타냅니다. R_s = 0.6인 경우, 크로마토그램에 두 개의 피크가 있음을 시각적으로 나타내는 유일한 표시는 피크 정점 근처의 작은 노치입니다. 머무름 시간(RT) – 주입 또는 샘플 도입이 시작된 시점과 피크 최대값이 출현한 시점 사이의 시간입니다. 선택성 – 분리 시스템을 구성하는 특정 이동상과 고정상에서 한 쌍의 분석물의 상대적 친화도 차이의 크기를 설명하는 데 사용되는 용어입니다. 스케일(스케일 업) – 분리별로 원하는 정제 분리물의 양에 따라 스케일이 결정되고 컬럼 직경, 시스템 및 하드웨어 요구 사항도 그에 따라 달라집니다. 그 양은 µg 단위의 소량 효소 분리 또는 정제부터 산업용 의약품 제조에 필요한 kg 단위의 대량까지 다양합니다. 스케일 업은 먼저 잠재적 가치를 입증한 후, 추가 평가를 위해 특정 화합물의 양을 늘리는 것을 말합니다. 계단식 그래디언트 – 그래디언트의 완만하고 포커싱된 부분을 전후하여 기울기를 유지함으로써 이러한 분리 부분에 대한 크로마토그래피 프로파일을 보존하는 분리 방법으로, 시스템 드웰부피(dwell volume)를 결정하는 데 자주 사용됩니다. 실라놀 – 샘플과 상호 작용할 수 있는 실리카 기질 컬럼 충전제에 결합되는 화학 그룹입니다. 분할기 – 질량분석기를 사용한 정제와 같이 샘플 스트림의 작은 부분을 파괴적인 검출기로 전환하는 데 사용됩니다. 고정상 – 유리 또는 금속 튜브에 충전되거나 개방형 튜브 모세관의 벽을 구성하는 다공성 고체(예: 유리, 실리카 또는 알루미나)입니다. 이동상은 충전 베드 또는 컬럼을 통해 흐르고, 분리할 샘플은 컬럼의 앞부분에 주입되어 이동상에 의해 시스템을 통과합니다. 서로 다른 물질이 두 상에 대한 상대적인 친화도에 따라 분포됩니다. 처리량 – 작은 부피의 작은 입자를 특징으로 하는 분석 컬럼 또는 큰 부피와 큰 입자를 특징으로 하는 분취용 컬럼을 사용하여 더 높은 선형 속도로 LC 분리를 수행할 경우 이점이 있습니다. 더 높은 분리능, 더 빠른 속도 및 더 높은 효율성은 일반적으로 더 높은 처리량으로 이어집니다. 그러면 실행당 또는 프로세싱 기간당 더 많은 양의 화합물을 정제할 수 있습니다.

용어집

1. 시스템 부피 – 이동상 용매가 혼합되는 지점부터 컬럼 헤드에 도달할 때까지의 드웰부피(dwell volume), 지연 부피, 시스템 부피입니다. 고압 혼합 LC 시스템의 경우 여기에는 믹서, 연결 튜브 및 Autosampler 루프가 주요 구성 요소로 포함되며, 그래디언트 응용 분야에서만 실질적인 중요성을 가집니다.
2. 분할 비율 – 질량 유도 정제 중에, 검출기로 이동하기 전에 샘플 스트림에서 지속적으로 “제거”되고 희석되는 물질의 양입니다.
3. 크기 배제 크로마토그래피 – 용액 내 크기에 따라 화합물을 분리하는 크로마토그래피 기법입니다.
4. 완만한 그래디언트 – 컬럼 부피당 유기 용매 농도 변화율이 느린 그래디언트로, 컬럼 매트릭스에 대해 유사한 친화도를 갖는 화합물을 분리하는 데 사용됩니다.
5. 분할 그래디언트 – 선택성이 다른 여러 화합물을 가장 높은 처리 속도로 분리하기 위해 기울기가 다른 여러 그래디언트가 사용되는 분리법입니다.
6. 감도(S) – 검출기로 들어가는 이동상에서 물질의 단위 농도 또는 단위 질량당 신호 출력에 해당합니다. 질량 흐름에 민감한 검출기의 경우 단위 질량에 대한 피크 높이의 비율입니다.
7. 역상 크로마토그래피 – 이동상이 고정상보다 훨씬 더 극성인 액체 크로마토그래피에 사용되는 용리 절차입니다.
8. 머무름 계수(k) – 샘플 성분이 이동상에 있는 시간과 고정상에 있는 시간을 비교 측정한 것입니다. 샘플 성분이 이동상의 속도로 컬럼을 통과하는 데 걸리는 시간에 비해 고정상에 의해 시간이 얼마나 지연되는지를 나타냅니다.
9. 분취용 크로마토그램 – 액체 크로마토그래피를 사용하여 추가 실험이나 사용에 충분한 양과 순도 수준으로 화합물을 분리하는 과정입니다.
10. 수동 분할기 – 정의된 분할 비율에 따라 주 흐름 또는 분취 흐름을 연속적으로 샘플링하는 데 사용되는 장치입니다. 질량 유도 정제에서 검출기 신호를 관리합니다.
11. 액체 크로마토그래피(LC) - 액체 형태의 이동상이 사용되는 분리 기술입니다.
12. 주입구 – 이동상 흐름과 샘플이 들어가는 컬럼 베드의 끝부분입니다.
13. 그래디언트 – 용리 강도가 증가하는 이동상을 형성하는 두 가지(또는 그 이상) 혼화성 용매 성분의 상대적 농도가 시간 경과에 따라 변화하는 것을 말합니다.
14. 이동상 변형제 – 분리 개선을 위해 크로마토그래피 용매에 혼합되는 첨가제입니다.
15. 질량 용량 – “질량 로딩”이라고도 합니다. 컬럼에 주입할 수 있는 물질의 최대량과 관심 화합물의 분리능이 적절하게 유지됩니다.
16. 선형 그래디언트 – 정의된 기간 동안 일정한 속도로 이동상 조성을 변화시키는 크로마토그래피 분리 기법입니다.
17. 이온화 – 분자가 전자를 얻거나 잃어 이온을 형성함으로써 음전하 또는 양전하를 획득하는 과정입니다.
18. 친수성 – 강한 극성 작용기를 가지고 있어 물 또는 극성 용매에 쉽게 용해되거나 상호 작용합니다.
19. 평형 – 그래디언트가 이용되는 크로마토그래피 분석법의 경우 다음 주입에 앞서 컬럼과 시스템을 초기 이동상 조건으로 되돌리려면 실행 후 평형 시간이 필요합니다. 적절한 평형을 이루기 위해 컬럼을 총 컬럼 부피(CV)의 5배에 분석법 시작 조건에서 시스템(Dwell) 부피의 3배를 더한 부피로 세척해야 합니다. Gradient Chromatography Column Re-equilibration, Performance Perspectives, Waters Corp. 1998. 그래디언트 기울기 – 그래디언트 분리 중에 컬럼 부피당 유기 용매 조성의 변화율입니다.
20. 효율성 – 충전층을 통과할 때 샘플 밴드가 분산되지 않도록 하는 컬럼의 성능을 나타내는 척도입니다. 효율적인 컬럼은 띠 분산 또는 띠 넓어짐을 최소화합니다. 효과적인 분리, 우수한 감도를 지원해야 하며, 복잡한 샘플 혼합물에서 유사 성분을 식별하기 위해서는 컬럼 효율이 높아야 합니다.
21. 드웰부피(dwell volume) – 이동상 용매가 혼합되는 지점부터 컬럼 헤드에 도달할 때까지의 시스템 부피입니다. 고압 혼합 LC 시스템의 경우 여기에는 믹서, 연결 튜브 및 Autosampler 루프가 주요 구성 요소로 포함됩니다. 이동상 성분이 등용매를 위해 온라인으로 혼합될 때 해당됩니다.
22. 검출기 – 물리적 또는 화학적 특성(예: UV/가시광선 흡광도, 차등 굴절률, 형광 또는 전도도)을 측정하여 용리액 조성의 변화를 나타내는 장치입니다. 일부 검출기(예: 전기화학, 질량분석 검출기)는 파괴적이기 때문에 샘플 성분의 화학적 변화에 영향을 미칠 수 있습니다. 검출기가 샘플을 파괴하는 경우 분할기가 전환에 이용됩니다.
23. 크로마토그래피 – 분리할 성분을 두 개의 상 사이에 분포시키는 분리 방법으로, 두 상 중 하나는 고정된 상(고정상)이고, 다른 하나(이동상)는 고정상에 대해 상대적으로 이동합니다.
24. 발색단 – 가시광선의 특정 파장을 흡수하고 다른 파장은 투과 또는 반사하는 분자의 일부입니다. 발색단은 두 개의 다른 분자 궤도 사이의 에너지 차이가​가시 스펙트럼 범위에 속하는 분자 영역입니다. 따라서 발색단에 입사된 가시광선은 전자를 바닥 상태에서 들뜬 상태로 만들어 흡수될 수 있습니다.

참고 문헌

• 분취용 크로마토그래피는 정제된 물질을 생성해야 하는 의약품 제조, 천연 생성물 분리 및 기타 중요한 작업에 매우 중요한 기술로 이용되고 있습니다. 분석법을 얼마나 잘 개발하는가에 따라 이 기술의 활용도가 결정됩니다. 정제 시스템에서 대규모 정제를 위한 적절한 하드웨어 및 소프트웨어를 갖추고 나면 소규모에서 대규모로 분석법을 이전하는 것이 일상적인 문제로 대두됩니다. 
  • Sarker, S., Latif, Z., Gray, A., “Natural Products Isolation” Second Edition. Humana Press. 2006.
  • Aubin, A. "UV-Directed Purification of a Small-Scale Organic Synthesis," Waters Corporation, Milford, MA USA. 2008.
  • Diehl, D. Fountain, K. Wheat, T. Joblonski, J. Yin, Z. Morrison, D; Collier, S. Murphy, B. Cleary, R. Compagnon, L., "Practical Chemistry Considerations for Purification." Waters Presentation. 2008.
  • Dolan, J. “A Guide to HPLC and LC-MS Buffer Selection.” Advanced Chromatography Technologies. www.ace-HPLC.com.
  • Jablonski, J et.al. “Effective Use of Temperature Control in Compound Isolation.” Waters Corporation, Milford, MA USA.
  • "At-Column-Dilution, Application Notes", Waters Corp, 2003.
  • 유용한 응용 자료 및 참고 자료에 대한 자세한 내용은 www.waters.com을 방문하여 위의 파란색 참조 번호를 검색창에 입력하십시오.