분취용 액체 크로마토그래피 입문서

크로마토그래피는 혼합물 내 성분의 화학적 특성에 기초해 혼합물을 분리하는 것으로 정의됩니다. 분취용(Prep) 또는 정제 크로마토그래피는 크로마토그래피를 사용하여 추가 실험이나 프로세싱을 수행하기에 충분한 양과 순도의 화합물을 분리하는 과정으로 정의됩니다. 연구자는 관심 화합물을 결정한 다음 해당 화합물을 출발 물질, 부반응 또는 기타 불순물로부터 성공적으로 분리하고 분별하는 분석법을 개발합니다. 전반적인 목표는 높은 처리량과 생산성에 대한 증가하는 요구를 충족하는 동시에 적절한 규모, 순도 및 재현성 요건을 충족하기 위해 정제 기술을 적용하는 것입니다.

정제 크로마토그래피는 대규모 제약회사부터 소규모 천연물 연구소에 이르기까지 많은 과학적 연구에서 활용됩니다. 응용 분야는 다를 수 있지만 일반적인 사용자들의 요구는 매우 유사하여, 대상 물질 분리에 95% 이상의 최종 순도를 얻는 것을 목표로 합니다.

이 입문서의 목적은 액체 크로마토그래피를 다루는 사용자들에게 빠르게 확장되고 있는 LC 정제 분야에 대한 입문 정보를 제공하는 것입니다. 크로마토그래피 분리법 개발, 분석법 스케일 업에 필요한 수식, 일반적으로 사용되는 분획 분취 모드 등의 기본 개념을 소개합니다. 역상은 대부분의 분취용 LC 응용 분야에서 사용되기 때문에 주요 분리 모드로 논의됩니다.

정제 분리의 성공 여부는 얻어진 분리물의 처리량, 회수율 및 순도에 의해 결정됩니다. 분리는 피크 분리 또는 “분리능”에 의해 결정됩니다. 다음 크로마토그래피 파라미터가 분리능에 가장 큰 영향을 미칩니다.

• 컬럼 충전제(고정상)
• 용매 강도

높은 분리능을 제공하는 조건은 분석법 개발 워크플로우를 통해 결정됩니다. 워크플로우는 매우 간단하지만 각 샘플의 고유한 특성에 따라 복잡성과 필요성의 측면에서 차이가 있는 여러 단계로 구성됩니다. 응용 분야나 샘플의 분리 모드(예: 역상, 이온 교환 등)에 관계없이 워크플로우는 일반적으로 동일합니다.

워크플로우를 설계하기 전에 고려해야 할 가장 중요한 요소는 표적 화합물의 특성입니다. 동일하거나 새로운 출처에서 알려진 화합물을 분리하는 경우 표적 화합물의 크로마토그래피 거동에 대한 문헌 정보를 쉽게 얻을 수 있으며 과거에 공개된 분석법 중에서 적절한 분리 방법을 어렵지 않게 선택할 수 있습니다. 그러나 화합물 유형이 알려지지 않은 미처리 추출물에 대한 분리 프로토콜을 설계하는 일은 이보다 어렵습니다. 이 경우에는 초기 분리 후 일련의 탐색적 실험을 수행하여 pK_a, 분자량, 용해도, 안정성, UV 스펙트럼 및 생물학적 활성도와 같은 관심 화합물 정보를 자세히 확인할 수 있습니다. 이 정보에 기초해 초기 분리법을 수정함으로써 화합물의 화학적 및 물리적 요구 사항을 충족할 수 있습니다. 이 정보는 분석법 개발에 도움이 될 뿐만 아니라 분리된 생성물의 안정성이 중요해지는 분취 후 과정에도 유용합니다.

첫 번째 단계에서는 샘플을 준비하고 빠른 스카우팅 그래디언트를 사용하여 일반적인 분리 작업을 수행합니다. 이 과정은 일반적으로 귀중한 샘플 재료를 보존하기 위해 소규모로 실행됩니다. 이 분리로부터 관심 화합물을 용리시키는 용매 조건을 계산할 수 있고 분리 조건을 더욱 최적화하여 분리능을 향상시킬 수 있습니다. 고순도 분리물을 생성하기에 적절한 분리능을 유지하면서 얼마나 많은 샘플을 로딩할 수 있는지 결정하기 위해 로딩 연구를 수행할 수도 있습니다.

분리법과 원하는 샘플 로딩이 결정되면 가능성이나 잠재적 가치가 있는 분리물에 대해, 항상은 아니지만 종종 분석법 스케일 업이 이루어집니다. 이 입문서에서 “스케일(또는 규모 확장)”이라는 용어는 응용 목적의 순도, 처리량 및 회수율 목표를 충족하는 데 필요한 기기 구성과 방법론을 나타냅니다. 분석법이 “스케일 업”되면 더 높은 샘플 로딩을 처리하는 데 적합한 하드웨어가 장착된 시스템으로 전환하는 것을 의미합니다. 스케일 업 과정에서는 본질적으로 일련의 스케일 업 계산과 하드웨어 변경을 통해 분리능을 유지하면서 분석 스케일 직경에서 분취 스케일 직경의 컬럼으로 전환하게 됩니다.

샘플

특정 화합물을 분리할 수 있는 샘플의 출처는 약물 중간체, 천연 제품, 기능 식품, 음료 또는 산업 제품 등 다양합니다. 물질을 추출하여 액체 매트릭스에 용해시킬 수만 있으면 크로마토그래피를 사용해 개별 성분을 정제할 수 있습니다.

샘플 추출에 사용되는 기술은 추출되는 물질의 복잡성에 따라 달라집니다. 천연 제품의 경우 일반적으로 샘플을 건조시킨 다음 미세 입자로 분쇄하여 추출 효율을 높입니다. 그런 다음 큰 샘플 크기의 경우 삼출(percolation), 작은 샘플 크기의 경우 침용(maceration)과 같은 기술을 사용하여 관심 화합물을 추출할 수 있습니다. 두 기술 모두 샘플 물질에 용매를 추가하고 초음파 처리, 교반 또는 침지 처리 후 용질을 분취하는 과정이 포함됩니다. 추출물을 분취한 후에는 모든 HPLC 샘플과 마찬가지로 주입 전에 필터에 통과시켜 미립자를 제거하고 기포를 없애야 합니다.

분리 모드

분취용 크로마토그래피에는 4가지 기본 분리 모드가 사용됩니다. 여기에는 역상, 순상, 겔 투과 및 이온 교환이 포함됩니다. 적절한 분리 모드는 분석 중인 샘플, 추출물 또는 혼합물과 고정상 및 용매와의 호환성에 따라 결정됩니다.

정제 개발에 사용되는 가장 일반적인 기술인 역상에는 용리 용매보다 극성이 낮은 고정상이 사용됩니다. 용리액은 물과 아세토니트릴 또는 메탄올의 혼합물이며, 샘플 이온화 정도를 제어하고 고정상에 존재하는 유리 미반응 실라놀기를 점유하기 위해 완충액(산 또는 염기)을 추가합니다. 실리카 기반 고정상의 결합상 물질 또는 흡착제는 피크 테일링을 줄이고 크로마토그래피 재현성을 개선하기 위해 알킬실릴 시약으로 유도체화됩니다. 이러한 유도체화 시약(실리안화)의 탄소 로딩 정도에 따라 여러 제조업체에서 만든 컬럼이 고유한 분리 특성을 가지게 됩니다.

빠른 시작 분리법 개발

역상 분리를 위해 종종 소규모 분석 컬럼(직경 4.6mm 이하)이 선택되며, 향후 용이한 스케일 업을 위해 길이와 충전제가 큰 직경(직경 10mm 이상)으로 제공됩니다. 우수한 분리를 위해 올바른 용매 시스템을 찾는 것이 중요합니다. 산성 화합물의 경우 일반적으로 산성 pH에서 수용성 이동상을 준비하는 반면, 메탄올 또는 아세토니트릴은 강용매로 준비됩니다. 농도 기준으로 0.1%에 해당하는 포름산은 UV 및 질량분석기에 모두 호환되기 때문에 일반적인 완충 첨가제로 이용됩니다. MS 호환성은 미지의 화합물을 식별하고 추가 연구를 위해 정제된 분리물을 준비할 때 유용합니다. 염기성 분자의 비이온화 형태를 유지하기 위해 산성 pH 대신 염기성 pH 이동상을 사용할 수 있습니다. 어떤 pH에서든 완충액을 사용하기 전에 컬럼 고정상에 동봉된 설명문에서 호환성을 참조해야 합니다.

수용성 이동상은 일반적으로 펌프 위치 A에 배치되고 강용매는 펌프 위치 B에 배치됩니다. 입문서 전체에 걸쳐 펌프 테이블의 수용성 및 강용매를 나타내기 위해 “A”와 “B”가 사용될 것입니다.