분취용 액체 크로마토그래피 입문서

분석법 스케일 업

분리물의 잠재적 가치가 처음 입증된 후에는 추가적인 평가를 위해 분리물의 양을 늘릴 수 있도록 분리법을 “스케일 업”할 수 있습니다. 분리능과 같은 소규모 분리 속성을 대규모에서도 쉽게 유지할 수 있습니다. 정의된 수학적 공식을 통해 분리를 고용량 컬럼으로 효과적으로 이전하려면 유량, 샘플 로드 및 시스템 하드웨어를 변경해야 합니다.

스케일 업의 첫 단계에는 일반적으로 초기 생물학적 평가에서 개선된 치료 특성을 가진 생성물 유사체에 대한 구조-활성 관계를 수립하는 부분까지 다양한 용도에 사용하기 위해 밀리그램에서 그램 수준으로 분리물을 생성하는 과정이 포함됩니다. 스케일 업을 위한 추가 단계에서는 전임상 및 임상 개발을 위해 100g에서 수 킬로그램까지 양을 늘리게 되며, 여기에 성공하면 전면적인 양산 체제로 전환할 수 있습니다. 이 규모에서는 cGMP(Good Manufacturing Practices)와 같은 문서와 품질 관리가 적용됩니다.

정제 규모	목표 양	일반적인 응용
분석적 미세 정제	µg	소규모 약물 발견 실험에 사용되는 효소 또는 화합물의 분리
Semi-Prep	mg	소규모 생물학적 대사산물의 구조 규명 및 특성 분석
Prep	g	분석 참조 표준물질의 독성학 스카우팅 연구
공정	kg	산업 규모의 약물 및 활성 화합물 제조

표 3. 크로마토그래피 규모, 목표량 및 관련 응용 분야.

스케일 업 워크플로우는 단계별 프로세스입니다. 스케일 업 계산은 정확하게 수행해야 하며, 그렇지 않으면 최종 결과물이 소규모 분리에서 얻은 분리능을 제공하지 못할 수 있습니다. 분석법 스케일링의 성공 확률을 높이고 머무름 시간과 선택성을 유지하려면 다음과 같은 몇 가지 요구 사항을 면밀히 고려해야 합니다.

소규모 및 대규모에서 동일한 이동상을 사용해야 합니다.
동일한 컬럼 케미스트리, 길이 및 입자 크기의 컬럼을 사용할 때 스케일 업이 가장 용이합니다(또는 초기 분석법의 컬럼 길이 대 입자 크기 비율인 L/dp가 유지된다면 입자 크기를 변경할 수 있음).
샘플은 동일한 희석액에서 동일한 농도로 준비해야 합니다.

그림 13. 스케일 업 워크플로우.

드웰부피(dwell volume) 측정

드웰부피(dwell volume)(지연 부피, 시스템 부피)는 시스템을 확장하거나 변경할 때 초기 용리 피크의 피크 분리능을 유지하는 데 중요합니다. 이 부피는 그래디언트 형성 지점에서 컬럼 헤드까지의 부피로 정의됩니다. 고압 혼합 LC 시스템의 경우, 이 부피는 주로 믹서, 연결 튜브 및 Autosampler 루프로 구성됩니다. 저압 혼합 시스템은 펌프의 업스트림에 용매를 결합하므로 추가 튜브와 펌프 헤드(또는 헤드)의 부피와 믹서, 연결 튜브 및 Autosampler 루프의 부피가 전체 드웰부피(dwell volume)에 기여합니다.

그림 14. 드웰부피(dwell volume)에 기여하는 정제 유로의 구성요소를 원(점선)으로 표시함.

등용매 분리를 위해 이동상 성분을 온라인으로 혼합하는 경우, 드웰부피(dwell volume)는 여전히 존재하지만 이동상 농도가 일정하기 때문에 크로마토그래피에서 차이가 관찰되지는 않습니다. 반면에 그래디언트 분석법은 시간에 따른 이동상의 농도 변화에 의존하여 피크를 분리합니다. 그래디언트 분석법에서는 드웰부피(dwell volume)의 보정을 통해 피크 머무름 시간이 유지되는데, 이는 특히 정제된 분획을 수집하려고 할 때 중요합니다.

드웰부피(dwell volume)를 측정하기 위해, www.waters.com/prepcalculator의 “분석-분취 그래디언트 계산기”에서 나와 있는 분석법에 따라 UV 흡광도가 다른 첨가제(예: 0.05mg/mL 우라실 또는 아세톤 0.2%의 아세토니트릴 용액)를 포함하는 이동상 A와 이동상 B 용매의 계단식 그래디언트를 사용할 수 있습니다.

1. 컬럼을 분리합니다.

2. 이동상 A로 아세토니트릴을 사용하고 이동상 B로 첨가제(0.05mg/mL 우라실 또는 0.2% 아세톤)를 넣은 아세토니트릴을 사용합니다.

3. UV 검출기를 254nm로 설정합니다.

4. 드웰부피(dwell volume)를 두 번 계산합니다(예: 원래 기기의 유량과, 대상 기기의 의도된 유량에 대한 드웰부피를 계산함).

5. 5분 동안 100% A에서 베이스라인을 수집합니다.

6. 5분에서 100% B로 계단식 변화를 프로그래밍하고 추가로 5분 동안 데이터를 수집합니다.

7. 100% A와 100% B 사이의 흡광도 차이를 측정합니다.

8. 이 흡광도 차이의 50% 지점에서 시간을 측정합니다.

9. 단계 시작과 50% 지점 사이의 시간 차이를 계산합니다.

10. 시간차에 유량을 곱합니다.

표 4. 드웰부피(dwell volume) 측정을 위한 절차.

용량

정제 크로마토그래피에서는 수집하려는 화합물에 대한 적절한 분리능을 유지하는 것이 가장 중요합니다. 컬럼 용량 또는 로드는 화합물과 인접 피크의 분리능으로 측정됩니다. 컬럼 용량은 주로 컬럼 길이와 직경의 영향을 받지만 용해도와 샘플 혼합물의 복잡성과 같은 다른 요인도 영향을 미칠 수 있습니다. 용량 추세는 다음과 같습니다.

용량은 주로 특정 샘플의 용해도에 따라 달라집니다.
용량은 단순한 혼합물의 경우 더 높습니다.
고분리능이 필요한 곳에서는 용량이 더 낮습니다.
용량은 로딩 조건의 영향을 받습니다.

			직경(mm)
길이(mm)	4.6	10	19	30	50
50	3	15	45	110	310
75	?	?	?	165	?
100	5	25	90	225	620
150	8	40	135	335	930
250	13	60	225	560	1550

적정 유량(mL/분)	1.4	6.6	24	60	164
적정 주입량(µL)	20	100	350	880	2450

표 5. 일반적인 분취용 컬럼 치수에 대해 예상되는 로딩 용량(mg). 예: 4.6 x 50mm 컬럼의 경우 예상 로딩 용량은 20µL 주입당 3mg입니다.

특정 관심 화합물의 용량은 로딩 연구를 통해 분석법을 스케일 업하기 전에 결정됩니다. 이러한 연구는 소규모로 수행되며 고농도로 샘플을 준비하고 주입량을 점진적으로 증가시키거나, 샘플을 여러 농도로 준비하고 주입량을 일정하게 유지하는 기법을 통해 실행됩니다. 두 기법 모두 주변 불순물로부터 관심 화합물의 적절한 분리능을 유지하는 최대 농도 또는 주입 부피를 결정하는 것을 목표로 합니다. 컬럼 용량이 결정되면 더 큰 직경의 컬럼 및 워크플로우에 대한 공식을 사용하여 스케일 업할 수 있습니다.

그림 15. 부피 로딩 연구. 별표가 있는 피크에 대한 로딩이 증가함에 따라 분리능이 감소한다는 점에 유의하십시오.

수식 10: 농도 로딩 스케일 업

따라서 4.6mm x 50mm 분석용 컬럼에서 1800µg(1.8mg) 로딩을 19mm x 50mm 분취용 컬럼에서 해당 로딩으로 스케일 업하려면 사용하십시오.

수식 11: 주입 부피 스케일 업

20µL 주입 부피 로딩을 스케일 업하려면 사용하십시오.

At-Column-Dilution

DMSO와 같은 강용매는 샘플 용해도를 향상시켜 컬럼 용량을 증가시킬 수 있습니다. 그러나 강용매를 대량으로 주입하면 크로마토그래피가 왜곡되어 성공적으로 분리할 수 있는 생성물의 양이 (증가하는 대신) 감소하는 결과를 초래할 수 있습니다.

강용매가 수용성 용매 스트림에 끼워진 플러그 형태로 주입기에서 컬럼 헤드로 운반될 때 왜곡이 발생합니다. 강한 샘플 용매가 수용성 용매로 희석된 플러그의 가장자리에서 샘플 침전이 발생할 수 있습니다. 이 침전으로 인해 유체 경로가 막히고 고압 시스템 중단으로 이어질 수 있습니다.

그림 16. 컬럼 내부에 이동상이 있는 샘플 플러그의 희석. 샘플이 강한 희석액으로 준비된 경우 수용성 이동상이 포함된 컬럼을 통해 이동할 때 샘플 플러그의 가장자리에서 침전이 발생할 수 있습니다.

침전으로 인해 시스템이 중단되지 않으면 샘플이 컬럼으로 들어가지만 샘플 플러그가 이동상으로 희석될 때까지 머무름이 발생하지 않습니다. 더 큰 주입의 경우, 샘플을 희석하는 데 필요한 부피는 컬럼을 따라 플러그를 상당한 거리로 이동해야만 얻을 수 있습니다. 이러한 경우 샘플은 컬럼 부피의 많은 부분을 차지하는 넓은 띠로 침전됩니다. 그 결과 많은 양의 용리액에 퍼져 있는 피크들이 완전하게 분리되지 못합니다. 주입되는 샘플의 부피와 질량을 엄격하게 제한하면 이러한 문제를 줄일 수 있습니다.

또는 적절한 머무름 시간을 보장하기 위해 샘플을 상당량의 물 또는 약용매로 희석하는 방법도 있습니다.

그림 17. 강용매에 샘플을 주입하는 기존의 접근 방식. 샘플 플러그는 컬럼을 따라 이동할 때 희석되어 피크가 왜곡됩니다.

처리량과 회수율 사이의 절충이 필요하다는 점에서 두 접근 방식 모두 완전히 만족스럽지는 않습니다. At-Column-Dilution 시스템에서는 샘플 플러그가 컬럼 입구로 운반되도록 재구성되어 수용성 희석액 흐름으로 연속적으로 희석됩니다. 컬럼으로의 이동 속도가 매우 빨라 침전이 발생할 수 없습니다. 그러면 샘플 분자가 매우 좁은 띠로 충전제에 흡착되어 잘 분해된 소량 피크와 마찬가지로 용리될 수 있습니다. At-Column Dilution을 사용하면 샘플이 루프 또는 컬럼 헤드에 덜 침전되므로 시스템 견고성이 향상됩니다.

샘플 성분 피크 간의 분리능이 향상되어 샘플 크기를 증가시킴으로써 분리에 필요한 주입 수를 줄일 수 있습니다. 실제로 At-Column Dilution을 사용하면 컬럼 로딩을 3배에서 5배까지 증가시킬 수 있는 경우가 많습니다. 고압 셧다운 발생률이 감소하고 컬럼 수명이 연장됩니다.

그림 18. At-Column-Dilution 시스템. 샘플 플러그는 컬럼 입구로 운반되어 수용성 희석액의 흐름으로 연속적으로 희석되고 침전이 발생하지 않습니다. 샘플 밴드가 잘 분해된 소량 피크로 용리됩니다.

그림 19. 기존 주입과 At-Column-Dilution에 의한 주입을 사용하여 강용매에 샘플을 용해했을 때의 결과 비교입니다. 컬럼에 133mg에 해당하는 1000μL를 주입했습니다.

유량 스케일 업

스케일 업 중에 분리 품질을 성공적으로 유지하려면 소규모 컬럼과 대규모 컬럼 간에 선형 속도를 일정하게 유지해야 하므로, 대규모 컬럼과 소규모 컬럼 간에 길이, 입자 크기 및 충전제가 동일한 경우에 유속이 가장 효과적으로 스케일 업됩니다. 유량을 확장할 때는, 최대 펌프 유량 및 역압 한계와 같은 시스템 하드웨어의 성능을 고려해야 합니다. 하드웨어가 유속 요구 사항을 충족하지 않는 경우 스케일 업에 적합하게 계측 구성을 적절하게 변경하는 것이 좋을 수 있습니다.

수식 12: 유량 스케일 업

예를 들어, 분석용 컬럼(5µm, 4.6mm x 50mm)의 유량이 1.5mL/분인 경우 분취용 컬럼(5µm, 19mm x 50mm)의 유량은 다음과 같이 계산됩니다.

그래디언트 기간 스케일 업

일반적으로 이동상의 선형 속도를 유지하도록 유량이 조정되는 경우, 스케일 업하는 동안 그래디언트를 변경할 필요가 없습니다. 컬럼 길이가 다른 경우, 소규모에서 얻은 분리 및 머무름 시간을 유지하기 위해 그래디언트 시간을 계산해야 합니다.

수식 13: 그래디언트 시간 스케일 업

예를 들어, 50mm 분석 컬럼에서 5분 동안 지속되는 선형 그래디언트 세그먼트는 100mm 분취용 컬럼에서 10분에 해당합니다.

Prep 계산기

질량, 유량 및 그래디언트 스케일 업 계산은 Prep OBD 컬럼 계산기 내에서 수행할 수도 있습니다. 이 계산기는 질량 로딩, 시스템 부피, 유량, 용매 부피 소비량, 질량 분광계 구동 크로마토그래피를 위한 분할 흐름 비율, 포커싱 그래디언트 UPLC 분석법에서 분취 분석법으로의 전환을 포함해 모든 분석-분취 스케일링 계산에 유용하게 활용할 수 있는 사용이 간편한 애플리케이션입니다. 이 애플리케이션은 www.waters.com/prepcalculator에서 액세스하거나 ChromScope와 같은 Waters 기반 정제 소프트웨어를 통해 액세스할 수 있습니다.