분취용 액체 크로마토그래피 입문서

등용매 분리 또는 포커싱 그래디언트로 관심 화합물이 적절하게 분리되지 않는 경우 용매, pH, 고정상 및/또는 온도를 변화시켜 분리법을 다시 개발할 수 있습니다. 이러한 형태의 수정이 분리에 큰 영향을 미칠 수 있으므로 이러한 변경 후에는 스카우팅 그래디언트를 수행한 다음에 분석법을 최적화해야 합니다.

용매

HPLC 이동상은 약용매, 강용매, 변형제의 세 가지 요소로 구성됩니다. 용매는 순도가 높고 검출기와 호환되며 샘플과 반응하지 않으면서 시스템 역압을 낮게 유지하기 위해 점도가 낮아야 합니다.

역상 크로마토그래피에서 약용매는 거의 항상 물인 반면, 강용매로는 대개 낮은 파장 범위에서 낮은 점도, 높은 강도 및 UV 적합성의 특징을 갖는 아세토니트릴 및/또는 메탄올이 사용됩니다. 아세토니트릴과 메탄올은 우수한 피크 모양을 제공하고 분리 후 쉽게 증발되며 대부분의 샘플과 잘 반응하지 않습니다.

크로마토그래피 분리에 사용되는 다른 용매와 마찬가지로 샘플 분석 중에 보고된 용매 UV 컷오프 값 이상을 유지하는 것이 중요합니다. 이 값 아래에서는 용매 조성의 변화가 검출기에 의해 베이스라인 표류 또는 기타 크로마토그래피 교란 요소로 기록됩니다.

분리에 사용되는 강용매에 따라 분리 및 피크 순서가 다를 수 있습니다. 관심 화합물에 가장 높은 분리능을 제공하는 용매를 예측하기는 어렵기 때문에 강용매의 선택은 시행착오를 통해 결정되는 경우가 많습니다. 경우에 따라 여러 강용매를 혼합하여(예: 50:50 아세토니트릴/메탄올) 원하는 용리 순서 또는 분리능을 얻을 수 있습니다.

pH

이동상 pH는 역상 분리를 위한 머무름 제어에서 매우 중요한 변수입니다. 화합물은 종종 하나 이상의 산성 또는 염기성 작용기를 포함하므로 대부분의 역상 이동상에는 pH 제어가 필요합니다.

산성이 pK_a보다 pH가 2 단위 이상 높거나 낮으면 각각 99% 이상 이온화 또는 비이온화됩니다. 대조적으로, 염기성은 pK_a 이하에서 이온화되고 pK_a 이상에서 비이온화됩니다. 비이온화된 형태는 극성이 낮으며(소수성이 강함), 따라서 역상 시스템에서 머무름성이 강합니다. 결과적으로, 산성은 낮은 pH에서 머무름성이 더 강한 반면 염기성은 높은 pH에서 머무름성이 더 강합니다.

이동상 pH가 관심 화합물의 pK_a에 가까우면 pH의 작은 변화가 머무름성에 큰 변화를 일으켜 분리 효과에 직접적인 영향을 줄 수 있습니다. 이동상의 pH는 완충액을 추가하여 제어합니다. 완충액은 소량의 산 또는 염기가 첨가될 때 pH를 유지합니다. pK_a의 ±1 pH 단위 내에서 사용될 때 가장 효과적이지만 pK_a에서 ±2 pH 단위의 적절한 완충을 제공할 수도 있습니다.

적절한 pH를 선택할 때는 컬럼의 안정성도 고려해야 합니다.

실리카 기반 컬럼은 pH 2와 pH 8 사이에서 가장 잘 작동합니다. 결합상은 낮은 pH에서 가수분해되기 쉽고 높은 pH에서는 실리카 백본의 용해도가 증가됩니다. 8 이상의 pH에서는 비실리카 기반 입자, 또는 높은 pH에서 안정성을 갖도록 특별히 만들어진 리간드 입자가 필요합니다. pH 한계 및 일반적인 취급 권장 사항은 컬럼과 함께 제공되는 설명서 또는 컬럼 제조업체 웹사이트에서 찾아볼 수 있습니다.

크로마토그래피 분석법을 정제 목적으로 사용하려는 경우 pH 조절에 사용되는 완충 첨가제는 정제된 분리물에서 쉽게 제거할 수 있도록 적절한 휘발성을 가져야 합니다. 또한 휘발성 첨가제를 사용할 때는 MS 소스에 오염이나 침전이 발생하지 않도록 주의해야 합니다. 포름산, 아세트산 및 암모늄 아세테이트와 같은 일반적인 첨가제는 이동상에 용해될 때 0.05-0.1% 농도에서 가장 효과가 좋습니다. 액체 크로마토그래피 분리에 가장 널리 사용되는 완충 첨가제인 인산염은 정제 또는 MS에 권장되지 않습니다.

5-10mM 사이의 완충액 농도가 권장됩니다. 완충액을 사용할 때는 준비 후에 완충액을 여과하고 인라인 침전을 방지하기 위해 사용하지 않을 때 펌프 라인을 세척하며 생물학적 성장물의 축적을 방지하기 위해 용액을 정기적으로 교체하는 것이 중요합니다.

고정상

컬럼 고정상은 분리에 상당한 영향을 미칩니다. 역상용 고정상은 C₁₈~C₈ 범위이거나 선택성과 분리 효과를 높이기 위해 처리된 리간드를 포함할 수 있습니다. 많은 실험실에는 컬럼 재고가 한정되어 있으므로 용매와 pH로 적절한 분리능이 얻어지지 않을 때는 고정상을 교체하는 것이 최후의 수단인 경우가 많습니다. Waters 역상 컬럼 선택성 차트(www.waters.com)에서 여러 컬럼 고정상 제조업체의 고정상 선택성을 비교해볼 수 있습니다. 이 도구는 초기 분석법 개발 과정에서 컬럼 선택성을 비교하는 데 매우 유용합니다.

길이

컬럼 길이는 분리 성능을 좌우하는 요소 중 하나입니다. 컬럼은 25mm, 50mm, 100mm, 150mm 및 250mm 등 다양한 길이로 구입할 수 있습니다.

컬럼이 짧을수록 플레이트 수가 적지만 빠른 분리에 적합하고 컬럼이 길수록 플레이트 수가 많아져 머무름 시간이 길어집니다. 길이가 길어지면 역압, 실행 시간, 용매 소비량 및 비용이 그에 비례하여 증가하므로 적절한 분리능을 제공하는 가장 짧은 컬럼이 가장 이상적인 선택입니다.

입자 크기

충전 물질을 통과할 때 샘플 밴드가 퍼지거나 분산되는 것을 막는 컬럼 효과를 "효율성"이라고 합니다. 입자 크기가 작을수록 입자 내에서 피크 분산이 더 낮기 때문에 효율성이 증가합니다. 효율성이 높으면 피크 너비가 좁고 분리력이 향상됩니다.

분취용 컬럼의 입자 크기는 일반적으로 5–10µm 범위인 반면 초고압 분석 분리에는 1.7–3.5µm 입자 크기가 사용됩니다. 매우 작은 입자 크기가 더 큰 효율성을 제공하지만 반대 급부로 컬럼 비용과 시스템 역압이 증가합니다. 미처리 샘플 혼합물에서 높은 유량으로 실행되는 대규모 분취용 컬럼은 이러한 이유 때문에 매우 작은 입자 크기로 제공되지 않는 경우가 많습니다.

컬럼

온도가 선택성에 영향을 줄 수 있으므로 컬럼 가열은 특정 샘플의 분리 향상을 위해 편리하게 사용할 수 있는 도구입니다. 이동상 점도와 전체 시스템 압력은 온도가 상승함에 따라 감소하여 시스템, 피팅 및 컬럼에 가해지는 변형을 줄임으로써, 궁극적으로 작동의 견고성을 높입니다. 온도는 머무름 시간을 줄이고 분리의 선택성을 변화시킬 수도 있습니다. 온도 변화가 피크 분리능을 증가 또는 감소시킬지 여부를 예측하기는 어렵기 때문에 그 효용성은 각각의 분리에 따라 달라집니다.

소규모 크로마토그래피에서는 온도 제어가 일상적이지만 분취 스케일의 정제를 위한 크로마토그래피를 수행할 때는 온도 조절을 위한 변수로 이용하는 경우가 드뭅니다. 첫째, 큰 직경의 컬럼은 외부에서 균일하게 가열하기 어려울 수 있습니다. 둘째, 큰 규모에 사용되는 고유량 분리는 유입되는 용매의 온도에서 유지되는 경향이 있습니다. 전기 블랭킷과 컬럼 오븐은 소규모 분리에 적합하지만 큰 컬럼을 직경 전체에 걸쳐 균일하게 가열할 수는 없습니다. 결과적으로, 컬럼 직경에 걸쳐 온도 그래디언트가 형성되어 크로마토그래피에 부정적인 영향을 미칩니다.

샘플 용해도를 유지하기 위해 온도 제어가 필요한 경우, 컬럼 헤드에 일정 길이의 튜브를 연결하고 가열된 수조에 분취용 컬럼을 배치하여 온도 그래디언트를 극복할 수 있습니다. 튜브의 길이는 유입되는 용매를 원하는 온도에서 평형화하기 위한 프리히터의 역할을 합니다. 향후 크로마토그래피에서 스케일 업(규모 확대)을 예상하고 있다면 주변 조건에 맞추고 최후의 수단으로 온도 제어를 사용하는 것이 권장됩니다.