포커싱 그래디언트 개발
다음 계산을 사용하여 샘플을 빠른 스카우팅 그래디언트로 분석한 후 관심 화합물에 대한 포커싱 그래디언트를 생성할 수 있습니다. 각 수식 뒤에는 이론적인 예가 나옵니다.
먼저, 스카우팅 그래디언트 실행에 사용된 기기에 대해 시스템 드웰부피(dwell volume)를 결정해야 합니다. 드웰부피(dwell volume) 결정에 대한 지침은 이 입문서의 “드웰부피(dwell volume) 결정” 섹션에서 찾을 수 있습니다. 또는 다음의 웹사이트에 있는 “분석-분취 그래디언트 계산기" 응용 도구에서 찾을 수도 있습니다:www.waters.com/prepcalculator
또한 스카우팅 실행에 사용된 컬럼에 대한 컬럼 부피도 결정해야 합니다. 실린더 부피 V = πr²h를 사용하고 충전제가 차지하는 부피를 보정하여 이를 계산할 수 있습니다(예: V = πr²h(66%)). “분석-분취 그래디언트 계산기” 응용 도구를 사용하여 이 계산을 수행할 수도 있습니다.
수식 1: 컬럼 부피
컬럼 부피 = π r² x 높이 x 사용 가능한 이동상의 66%/1000, mm³를 mL로 변환
예:
CV = 3.14 x (4.6mm/2)² x 50mm x 0.66/1000
CV = 548mm³ = 0.548mL
수식 2: 그래디언트 형성과 검출기 사이의 오프셋 부피
오프셋 부피 = 시스템 부피* + 컬럼 부피
*시스템 부피 또는 드웰부피(dwell volume)
예:
차오프셋 부피 = 1.04mL + 0.548mL
오프셋 부피 = 1.588mL
수식 3: 검출기까지의 시간
검출기까지의 시간 = 오프셋 부피(mL)/유량(mL/분)
예:
검출기까지의 시간 = 1.588mL/1.5mL/분
검출기까지의 시간 = 1.06분
수식 4: 용리 농도가 형성된 시간
용리 농도가 형성된 시간 = 관심 피크 머무름 시간 – 검출기까지의 시간 – 그래디언트 유지
예:
용리 농도가 형성된 시간 = 6.0분 – 1.06분 – 0.0분
용리 농도가 형성된 시간 = 4.94분
수식 5: 퍼센트 용리 농도
% 용리 농도 = 용리 농도가 형성된 시간/길이 스카우팅 그래디언트 세그먼트 x 스카우팅 변경 + 초기 스카우팅 그래디언트 %
예:
% 용리 농도 = 4.94분/6.0분 x 90% + 5%
% 용리 농도 = 79.1%
수식 6: 컬럼 부피(CV)의 수
# 컬럼 부피 = 1 컬럼 부피/mL x 유량 mL/분 x 길이 스카우팅 그레디언트 세그먼트
예:
# CV = 1 CV/0.548mL x 1.5 mL/분 x 6분
# CV = 16.4
수식 7: 스카우팅 그래디언트 기울기
스카우팅 그래디언트 기울기 = 스카우팅 그래디언트 변화 %/# 컬럼 부피
예:
스카우팅 그래디언트 기울기 = (95% – 5%)/16.4 CV
스카우팅 그래디언트 기울기 = 5.49%/CV
수식 8: 포커싱 그래디언트 기울기
포커싱 그래디언트 기울기 = 1/5 x 스카우팅 그래디언트 기울기
예:
포커싱 그래디언트 기울기 = 1/5 x 5.49%/CV
포커싱 그래디언트 기울기 = 1.1%/CV
포커싱 그래디언트 세그먼트는 예상 용리 백분율보다 5% 아래, 3-5% 위로 생성됩니다. 예를 들어 용리 백분율은 79%입니다.
수식 9: 포커싱 그래디언트 세그먼트의 시간 길이
포커싱 그래디언트 세그먼트의 시간 길이 = % 범위 x (1/스카우팅 그래디언트 기울기) x 컬럼 부피 x (1/유량)
예:
포커싱 그래디언트 세그먼트의 시간 길이 = (79%+5%) - (79%-5%) x (1/1.1%) x (0.548mL) x (1/1.5mL/분)
포커싱 그래디언트 세그먼트 시간 길이 = 3.32분
마지막 단계는 이전 수식에서 계산된 값을 사용하여 포커싱 그래디언트를 작성하는 것입니다.
