분취용 액체 크로마토그래피 입문서

분리법을 개발하고 원하는 규모로 스케일 업한 후에는 최종적으로 관심 화합물을 분리하거나 분취합니다. 피크 용리를 모니터링하면서 작업자가 수동으로 분획을 분취하거나 검출기 신호 또는 머무름 시간을 기반으로 분획 분취를 자동화할 수 있습니다.

분획 지연 시간

사용자가 지정한 분취 트리거 기준을 충족하는 피크가 검출기에서 검출되면 분획 분취가 이루어집니다. 피크가 검출기에 있을 때는 아직 분획 분취기(Fraction Collector)로 이동하지 않은 것입니다. 분획 분취기(Fraction Collector)가 너무 일찍 트리거되면 분획 분취기에서 피크를 놓칠 수 있습니다. 분획 분취 시기를 올바르게 지정하려면 시스템 고유의 분취 지연 시간을 미리 결정해야 합니다. 한 가지 검량 방법으로, 농축된 염료를 주입하고 검출기에서 검출되는 시간과 분획 분취기(Fraction Collector)에 도달하는 데 걸리는 시간을 비교합니다. 분획 지연 시간 검량은 일반적으로 일회성 프로세스이며 일단 소프트웨어에 입력하면 어떤 유량에 대해서도 다시 계산할 수 있습니다. 흐름 분할기가 추가되는 경우와 같이 검출기에서 분획 분취기(Fraction Collector)로의 유동 경로가 변경되면 분획 지연 시간을 다시 검량해야 합니다.

수동 분획 분취

수동 분취는 매우 간단하고 쉽습니다. 화합물의 용리가 온라인 기반 기기 소프트웨어의 실시간 신호 플롯을 통해 시각적으로 모니터링되는 동안 사용자는 분획 분취기(Fraction Collector)에서 전환 밸브를 전환시킵니다. 수동 분획 분취는 정제 실행의 원하는 부분만 분취하기 때문에 탁월한 유연성을 제공하지만 자동화의 부족으로 인해 처리 속도가 느린 경향이 있습니다.

피크 기반 분획 분취

피크 기반 트리거링은 검출기 신호를 기반으로 분획을 분취하는 자동화된 방법입니다. 크로마토그램의 피크가 분획 분취기(Fraction Collector)를 트리거해야 하는지 여부를 결정하는 데 사용되는 파라미터는 일반적으로 피크 높이, 임계값 및/또는 그래디언트입니다.

피크 기반 분획 분취에 대한 가장 일반적인 접근 방식은 높이 또는 임계값을 기반으로 합니다. 신호가 미리 정의된 검출기 높이에 도달하는 즉시 분획 분취가 트리거됩니다. 신호가 미리 정의된 높이 아래로 떨어지면 분취가 중단됩니다.

그래디언트에 의한 분획 분취가 더 어려운 분취 방법인 경우가 많지만, 베이스라인이 분리되지 않은 피크를 수집하는 데 사용할 수 있습니다. 기울기로 분취할 때는 크로마토그램의 1차 도함수를 따라 감지된 수학적 변곡점에서 소프트웨어에 의해 분획 분취가 자동으로 트리거됩니다.

질량 검출에 의한 분획 분취

질량 기반 분획 분취에서는 사용자가 대상으로 지정한 질량을 가진 화합물만 분취됩니다. 결과적으로, 피크 기반 분취보다 질량에 의한 분취가 더 효율적일 수 있습니다. 질량 기반 분획 분취를 위한 요구 사항은 다음과 같이 요약됩니다.

• 화합물의 분자량을 알아야 합니다.
• 질량 검출을 위해 화합물이 이온화되어야 합니다.

분취 분석

분획이 분취되면 분취 용기에서 직접 분석하거나 용매를 제거하여 정제 생성물을 얻을 수 있습니다. 회전 증발기(rotavap)를 사용하여 분획을 건조시킬 수 있습니다. 이 도구를 사용하면 샘플에서 용매가 증발되고 수용성 부분이 동결 건조됩니다. 무기 완충액을 사용했거나 수용성 비중이 특히 큰 경우 분획을 역상 SPE 카트리지를 통해 통과시켜 표적 화합물을 포획할 수 있습니다( 탈염으로 알려져 있음). 그런 다음 더 쉽게 증발될 수 있는 소량의 유기 용매로 포획된 화합물을 용리시킵니다.

회수율 추정치는 UV, IR, MS, NMR, X-레이, 분석 및/또는 구조 해석과 같은 다양한 일상적 분석 기술을 사용하는 분획 분석을 통해 확인할 수 있습니다. 표준물질이 있으면 간단히 문헌 데이터와 분리물질을 직접 비교할 수 있지만, 표적 화합물이 알려지지 않은 경우에는 순도 및 안정성 프로파일을 수립하기 위해 다양한 물리적, 화학적 및 분광학적 기술을 포함하는 광범위하고 포괄적인 체계적 접근이 필요합니다.

수식 14: % 회수율

분리물질을 분석할 때 순도, 회수율 또는 활성도가 예상과 다른 경우 다음 상황에 대해 분리물질을 평가하십시오.

• 분취 용기에서 직접 테스트할 때는 농도 그래디언트가 형성될 수 있습니다. 결과적으로, 순도 결과는 분취 용기에서 샘플을 추출한 위치에 따라 달라집니다. 대표성이 있는 결과를 얻으려면 분석 전에 샘플을 잘 혼합해야 합니다.
• 샘플이 DMSO와 같은 강용매에 가장 잘 용해되지만 이동상에는 용해되지 않는 경우, 분취 용기에 보관되어 시간이 지남에 따라 분취한 분획이 결정화됩니다. 순도 및 농도 분석을 위해 액체상을 추출하는 경우, 결과는 용해된 부분만을 나타냅니다.
• 분취, 순도 테스트 및 활성도 테스트 사이에 발생하는 분해로 인해 활성 화합물이 손실될 수도 있습니다. 또한 건조 과정에서 분해될 수 있습니다. 따라서 활성도 테스트는 거의 항상 건조 전후에 수행됩니다.
• 활성 화합물이 컬럼에 남아 있습니다.
• 활성 화합물은 분리 프로세스에 사용된 조건에서 불안정합니다.
• 추출 용액이 이동상과 호환되는 용매에서 준비되지 않아 침전이 발생할 수 있습니다.
• 대부분의 활성 화합물은 넓은 분획 범위에 걸쳐 확대되므로 분획에 존재하는 화합물 중 일부 양을 검출하지 못하는 문제로 이어질 수 있습니다.
• 추출물의 활성도는 미처리 샘플에 있는 다른 화합물로 인한 것일 수 있으며 개별적으로는 활성이 없습니다.
• 분리물질은 근접하게 용리되는 불순물이 흡수되지 않는 UV 파장에서 분취된 경우, 예상만큼 순수하지 않을 수 있습니다.

분리물질이 목적으로 하는 순도, 처리량 또는 회수 요구 사항을 벗어나는 경우, 동일한 분리법을 사용하여 분리물질을 다시 정제하거나 다른 컬럼 선택성을 사용하여 완전히 새로운 분리법을 개발할 수 있습니다. 원하는 순도, 처리량 및 회수 목표를 충족하기 위해 정제에 투자할 시간과 노력을 결정하는 것은 크로마토그래피 작업자의 몫입니다.