아미노산 가수분해와 분석 종합 가이드

소개

식품과 사료, 바이오의약품을 연구 개발하고 상용화하는 과정에서 아미노산을 정확히 분리, 확인, 정량 분석하기란 만만치 않은 작업입니다. 이 과정에서 많이 활용되고 있는 것이 샘플 가수분해로 펩타이드, 단백질 등의 결합 아미노산 분석 워크플로우에서 첫 단계가 되는 중요한 작업입니다. 가수분해를 통해 분리된 아미노산을 분석할 수 있습니다. 이러한 아미노산은 이온 교환기 또는 역상 크로마토그래피 분석법으로 분리 가능합니다.

까다로운 샘플 전처리 워크플로우를 고려하여, 샘플 가수분해에 대한 유용한 지침을 제공하고자 본 문서를 작성하였습니다. 여기 수록된 내용은 이 프로세스의 입문서 역할에 한정됩니다. 샘플 종류와 복잡도에 따라 여기 수록된 가수분해 방법이 유용하지 않을 수도 있습니다. 가수분해 또는 특정 절차에 관한 자세한 내용이나 문제 해결 요령은 가수분해를 진행한 기기 제조업체 또는 담당 기관(Association of Official Analytical Chemists, AOAC)에 문의하십시오. Waters는 특정 샘플 종류에 관해서는 지침을 제공하지 않습니다.

Waters에서는 가수분해된 샘플(분리된 아미노산)을 분석할 때 광학 검출로 아미노산 분석이 가능하도록 프리 컬럼 유도체화를 이용하는 솔루션을 다양하게 공급하고 있습니다. 이것은 워크플로우에 필수적인 요소이므로 Waters HPLC (AccQ•Tag) Method와 UPLC Amino Acid Analysis (AccQ•Tag Ultra) Solution에 관한 내용이 본 자료에 짤막하게 수록되어 있습니다. Waters Pico-Tag(이소티오시안산 페닐 프리 컬럼 유도체화 시약) 아미노산 분석 방법에 관한 사항은 본 문서에 수록되어 있지 않습니다. Pico-Tag Method도 이용은 가능하지만, AccQ•Tag Method가 성능 면에서 우월해 새 용도에 더 적합합니다.

참고: 본 문서에는 정제 단백질/펩타이드와 식품, 사료의 가수분해 및 아미노산 분석에 관한 내용만 담겨 있습니다. 소변, 혈청, 비경구영양공급 제품, 세포 배양액 샘플에 포함된 아미노산을 분석하는 내용은 없습니다. 이 분야에 관한 사항은 www.waters.com/AAA 및 www.waters.com/Kairos를 참조해 주십시오.

일반 분석 가이드라인과 권장사항

아미노산은 환경 곳곳에 존재하기 때문에 일부 아미노산, 특히 세린(Ser)과 글리신(Gly) 같은 경우는 원하는 샘플 분석에서 20pmol 이상의 백그라운드 오염이 나타나기 쉽습니다. 각별히 주의한다면 이러한 오염을 줄일 수 있습니다. 아니면, 아미노산당 200 pmol 이상 얻어지도록 샘플을 충분히 가수분해한다면 백그라운드 오염의 기여도를 비율을 10% 아래로 낮출 수 있습니다. 이와는 별개로, 1 pmol 이하까지 검출할 수 있는 최신 유도체화 기법과 크로마토그래피 시스템의 감도를 제대로 이용하기 위해서는 실험실의 청결과 우수한 기법이 대단히 중요합니다. 오염의 원인은 다양합니다. 불결한 글래스웨어, 실험실 내 동물, 공기 중 먼지, 지문, 탤컴 파우더 등이 대표적입니다.

저농도 아미노산 분석의 질을 높이는 데 완벽한 시스템은 없지만 다음 사항을 고려하고 실천한다면 어느 정도는 질을 높일 수 있습니다.

모든 6 x 50mm 가수분해 튜브(p/n: WAT007571)를 500°C로 밤새 열분해하여 유리의 청결도를 최대한 높입니다. 냉각된 가열로에서 튜브를 꺼내 알루미늄 호일(아세톤으로 닦은 것)로 감싼 후 빛이 들지 않는 곳에 보관합니다.
피펫이나 일회용 팁, 실린지, 기타 액세서리에서 오염물질이 유입되지 않도록 주의합니다.
가수분해 전 및 가수분해 과정에서 언제나 깨끗하고 분말이 없는 장갑과 깨끗한 핀셋을 이용합니다. 수술용 마스크가 적합할 수도 있습니다.
항상 새 시약만 사용합니다. 시약은 모두 오염원이 될 수 있습니다. 가장 좋은 방법은 시약 병을 개봉한 즉시 작고 깨끗한 용기에 나눠 보관하는 것입니다.
매주 blank 유도체화 물질을 이용해 시약의 품질을 점검합니다.
가급적 증기상 가수분해 절차를 이용합니다. 불순한 HCl이 가수분해의 신뢰도를 떨어뜨릴 수도 있습니다. 정비점(constant boiling) HCl를 사요했을 때 가장 일관성 높은 결과가 나왔습니다. 고순도 시약급 농축 HCl은 대개 그만큼 깨끗하지 않고 정비점(constant boiling) 급보다 염소 농도가 상당히 높습니다.
시험수와 완충액도 대조 샘플로 백그라운드 오염에 일조합니다. 예컨대, 실험실 이중 증류수 때문에 아미노산 농도가 허용치 이상으로 높아지기도 합니다. 물 품질 확보를 위해서는 정제 시스템(18.2mΩ-cm 물)의 사용을 권장합니다.
가수분해용으로 적합한 대조 blank는 샘플과 똑같이 처리한 샘플 튜브입니다. 여기에는 가수분해 단계가 포함됩니다.