아미노산 가수분해와 분석 종합 가이드

본 가이드에서는 주로 아미노산 분석의 초기 단계인 가수분해에 필요한 샘플 전처리를 중점적으로 설명하지만, 이 섹션에서는 아미노산 분석에서 보다 일반적인 정량 분석 방법에 대해 간략히 소개하고자 합니다. 여기 소개하는 사례에서 아미노산 분석의 결과는 이미 획득하였으며, 오리지널 샘플의 농도는 계산해야 합니다. 이 사례에서는 유도체화를 할 때 AccQ•Tag 또는 AccQ•Fluor 시약을 이용했다고 가정합니다.

정량 분석 전 조치사항:

• 피크를 모두 정확히 확인해야 합니다.
• 머무름 시간이 서로 맞지 않으면 검량 테이블에서 값을 확인합니다.
• 피크가 모두 올바르게 적분되었는지 확인합니다.

일부 분석은 단순히 대상 샘플의 농도를 구하는 것을 목표로 합니다. 이 결과는 대개 µmol/L와 같은 몰 농도로 표시됩니다. 크로마토그래피 결과는 일반적으로 피코몰(pmol)로 표시됩니다. 농도를 구할 때에는 크로마토그래피 소프트웨어에서 얻은 아미노산 피코몰을 주입 부피로 나누고, 이 값에 유도체화된 부피로 나눈 희석액의 부피를 곱합니다. 마지막으로, 희석 배수를 곱하고 단위를 µmol/L로 바꿔 주면 계산은 끝납니다.

계산 예시:
오리지널 샘플 속 아미노산의 농도를 구할 때에는 보고된 값을 기준으로 다음 등식을 이용합니다.

설명:

pmol AA = 샘플 Vi의 아미노산 보고량 = 주입 부피 µL, 일반적으로 1µL

Vd = 유도체화된 부피(µL), 일반적으로 10µL

Vr = 샘플 재용매화에 사용된 희석액의 부피(µL Dil.) 배수 = 희석 배수

예:

가수분해된 단백질 샘플 중에서 최초로 100µL를 분취하여 내부 표준물질로 1:1 희석하였습니다. 10µL 분량을 유도체화하였습니다. 주입 부피는 1µI이고 아스파라긴(Asn)의 보고된 값은 312.5 pmole이었습니다.

Asn 농도(µmol/L)는 다음과 같습니다.

가수분해된 단백질의 아미노산 조성을 구할 때에는 샘플 속 성분의 몰 비를 계산해야 합니다.

순수 단백질마다 그 안에 들어 있는 아미노산별로 잔류물의 스토이치오메트릭 수가 다릅니다. 이상적으로는, 분석의 결과에서 몰 비가 정수로 나와야 합니다. 관찰된 값이 이 이상값에 어느 정도 근접하느냐는 단백질 또는 펩타이드의 순도와 가수분해 조건의 적합성, 아미노산 분석의 질에 따라 결정됩니다.

예 1(아래 표와 같음):

1. (분석에서 나온) 아미노산별로 관찰된 피코몰을 표로 만듭니다.
2. 검사를 통해 각 아미노산별 잔류물 수(추정 조성)를 추정합니다. 참고: 관찰된 잔류물은 각 아미노산의 상대 몰 농도입니다. 관찰된 피코몰 전체를 양이 제일 적은 아미노산으로 나누고 얻은 값을 반올림합니다.
3. 아미노산 전체에 대해 피코몰과 잔류물의 수를 더합니다.
4. 관찰된 피코몰의 합을 추정 조성의 합으로 나눠 평균 pmol/잔류물을 구합니다.
5. 관찰된 피코몰 각각을 피코몰/잔류물 값으로 나눠 관찰된 조성을 구합니다.

경고: 큰 단백질은 정밀도가 더 높아야 하기 때문에 잔류물 수를 추정하기가 어렵습니다.

경고: 아미노산 중에는 가수분해로 회수할 때 편차가 생기는 것도 있습니다 (Ser, Tor, Tyr, Met은 품질 저하가 일어날 수도 있고 Val과 Ile 결합은 절단이 어려울 수도 있습니다).

참고: 이 경우 정량 분석을 개선하기 위해서는 시간 경과에 따른 연구를 권장합니다. 일반적으로 샘플은 24, 48, 72(또는 96)시간 동안 가수분해합니다. 불안정한 아미노산 값은 0시간으로 다시 외삽하여 구하고 Ile와 Val의 값은 가장 긴 가수분해에서 값을 가져옵니다.

예 2:
앞서 지적했듯이 경우에 따라서는 몰 비중(단백질 100 잔류물당 각 아미노산의 잔류물 수)만 계산해도 됩니다. 이것을 구하는 방법은 다음과 같습니다.

단백질의 분자량 추정값이 있다면 두 가지 방식으로 조성의 근사값을 계산할 수 있습니다.

1. 샘플 분자량(MW)을 추정합니다.
2. 아미노산의 총 수율을 피코몰 단위로 합산합니다.
3. 분자량을 아미노산의 평균 분자량인 110으로 나눕니다. 주의: 이 값은 총 사슬 길이 또는 총 아미노산을 근사값으로 추정한 것입니다.
4. 총 수율을 사슬 길이로 나눕니다(주입한 샘플의 몰 양과 같습니다).
5. 아미노산마다 그 양을 주입한 몰 양으로 나눕니다(그 결과는 몰당 잔류물 수와 같습니다). 적분한 양에서 벗어나는 정도를 분석합니다.
6. 분모(주입한 몰 양)를 살짝 조정해가며 적분량(5단계에서 구한 것) 대비 편차를 최소화합니다. 이 단계는 컴퓨터 스프레드시트 프로그램이나 최소 편차를 찾아내는 아미노산 소프트웨어를 이용하면 간단하게 처리할 수 있습니다.
7. 불안정한 아미노산과 안정적인 결합 형성자의 값은 가수분해에서 회수가 잘 안 되기 때문에 적분량과 크게 다를 수도 있음을 기억해야 합니다.

이 방법은 샘플에 대한 더 많은 지식을 필요로 합니다.

1. 분석에서 다음 두 기준을 충족하는 아미노산을 선택합니다.
   • 가수분해 및 유도체화에서 우수한 수율을 제공합니다(예: Asp, Glu, His, Arg, Ala, Pro, Leu, Phe, Lys). Gly는 일반적인 백그라운드 오염물질일 때가 많기 때문에 좋은 선택이 아닐 수도 있습니다. 또한
   • (추정된 샘플 분자량 및 아미노산 수율에 기반하여) 샘플 몰당 몇 개의 잔류물만 있을 수 있습니다. 위 정보는 메티오닌에서 선택적으로 인텍 폴리펩타이드 사슬을 절단하는 사이아노젠 브로마이드 분해 절차에서 얻을 수 있습니다.
2. 이 정보를 토대로 이 아미노산의 적분값을 선택합니다.
3. 선택한 아미노산의 수율을 선택한 적분값으로 나눠 주입한 샘플의 추정 몰 양을 구합니다.
4. 7.3.2.1의 5단계와 6단계를 따릅니다.
5. 정수에서 더 작은 편차가 얻어지는지 값(하나는 선택한 적분값보다 크고 하나는 작은 것)을 확인합니다.

오리지널 샘플에 포함된 펩타이드 또는 단백질의 농도는 각 아미노산의 피코몰 수와 상응하는 분자량을 곱하여 나온 값을 모두 더하여 구할 수 있습니다.

섹션 7.3.1의 표에 나와 있는 예를 이용하여 다음과 같이 계산해 보겠습니다.

계산 예시:

샘플 속 Asp(아스파라긴): 분자량 133.10g/mole의 아미노산 220 피코몰이 관찰되었으며 이 결과에 기반해 다음과 같이 계산합니다.

원하는 아미노산마다 같은 계산식을 적용합니다. 아래 표는 아미노산별로 계산한 피코그램입니다. 샘플에서 주입된 피코그램 단백질의 총량은 우측 하단에 나와 있습니다.

위에서 계산한 값은 식품과 사료를 분석할 때 모두 적용됩니다. 단 사료 분석에서는 메티오닌, 시스테인처럼 성장을 제한하는 아미노산의 함량 정보가 더 중요합니다. 여기에서 많이 관심을 두는 대상은 샘플 속 각 아미노산의 중량 비중입니다.

아미노산의 중량 비중을 계산하는 방법은 다음과 같습니다.

계산 예시:

보고된 양(Amount)의 값(pmol/µL)에는 잔류물 MW(gm/mol)과 변환 계수(있을 경우)를 곱해야 합니다.

이어서, 보고된 양(g/mol)에 희석 배수를 곱합니다. 여기서 나온 값을 샘플의 중량으로 나누고 이어서 100을 곱해 백분율로 변환합니다.

계산 예시:

설명:

    양 = 아미노산의 양(g/mL)

    희석 = 샘플의 희석

샘플 중량 = 중량(mg)

이 분석법에서는 내부 표준물질을 사용해야 합니다.

계산 예시:

내부 표준물질의 피크 면적에 아미노산의 중량(mg)을 곱합니다. 여기에서 얻은 값을 아미노산의 피크 면적에 내부 표준물질의 무게를 곱하여 얻은 결과값으로 나눕니다.

설명:

    RF_aa = 아미노산의 반응 계수

    P_n = 내부 표준물질의 피크 면적

    P_aa = 샘플 속 아미노산의 피크 면적

    W_aa = 아미노산의 중량(mg)

    W_n = 내부 표준물질의 중량(mg)

함량(%)을 계산할 때에는 먼저 아미노산의 피크 면적에 계산된 반응 계수를 곱합니다. 여기에 내부 표준물질 계수를 곱합니다. 이어서 내부 표준물질의 피크 면적과 분석 대상 샘플의 중량을 곱한 값으로 나눕니다. 마지막으로 백분율로 변환합니다.

설명:

    P_aa = 아미노산의 피크 면적

    P_n = 내부 표준물질의 피크 면적

    RF_aa = 계산된 반응 계수

    IS = 계산된 내부 표준물질 계수

예:

사료 샘플에 포함된 아미노산에 대해 다음 값을 계산했습니다.

    아미노산의 중량(W_aa) = 0.5mg

    아미노산의 피크 면적(P_aa) = 100,000

    내부 표준물질의 피크 면적(P_aa) = 110,000

    내부 표준물질의 중량(W_n) = 0.5mg

    시험 분량의 중량(W_s) = 10mg

0.5mg x 2 x 10-2 = 0.05

대상 아미노산은 사료 중량 기준 0.9% 수준으로 존재합니다.