아미노산 가수분해와 분석 종합 가이드

앞서 설명했듯이 샘플 가수분해용으로 여러 가지 장비를 사용할 수 있습니다. 어떤 기기를 사용하든 가수분해 방법은 크게 세 가지입니다. 단백질의 총 조성을 측정할 때 이용하는 산성 가수분해와 시스테인, 메티오닌 등 황이 포함된 아미노산을 측정할 때 이용하는 퍼포믹산 산화 방식의 산성 가수분해, 트립토판 회수율을 평가할 때 이용하는 알칼리성 가수분해가 그것입니다. 종래의 샘플 가수분해용 장비 중에는 프로세스가 오래 걸리는 것도 많은데, 마이크로웨이브 가수분해용 기기는 상당히 빠릅니다. 위 세 가지 방식 모두에 마이크로웨이브 가수분해를 적용하면 정확도, 재현성, 속도, 견고성이 모두 좋아지고 가수분해 조건을 더 잘 제어할 수 있습니다.

그림 7의 CEM Discover SP 마이크로웨이브 반응 시스템(CEM Corporation 3100 Smith Farm Road Matthews, NC 28104)은 마이크로웨이브 기술을 이용해 15분 만에 아미노산 분석에 필요한 단백질과 펩타이드의 가수분해가 가능합니다. 그림 8과 같이, 마이크로웨이브 에너지를 직접 적용하고 통합 IR 온도 센서를 이용하기 때문에 가열이 빠르고 샘플마다 설정 온도를 관리할 수 있습니다. 현장에서 교반(stirring)하기 때문에 샘플 전체로 열이 고르게 퍼지고, 반응 후에 퀀칭(quenching)을 하므로 샘플이 몇 초 만에 식습니다.

이어지는 섹션에서는 시스템 설치와 운영을 간략히 설명합니다. 더 자세한 사항은 CEM Corporation에 문의하거나 시스템 설명서를 참조하십시오.

• 시스템에 필요한 전기는 110–140 VAC, 60Hz, 10A, 120 VAC입니다.
• 이 시스템은 환기가 필요합니다.
• 이밖에 25~60psi의 압축 공기 또는 압축 질소가 필요합니다.
• 또한 시스템에서 305cm(10피트) 이내 거리에 랩탑(CEM 제공)을 배치해야 합니다.

• 산성 가수분해용 6N HCl, 1:1 농축 HCl: 탈이온수.
• 염기성 가수분해용 4N NaOH, 16g의 고체 NaOH를 100mL 탈이온수에 용해.
• 퍼포믹산(과산화만), 9:1 포름산:30% 과산화수소.
• Discover SP용 10 또는 35mL 바이알. 교반 막대와 마개 포함.
• 결정질 페놀.

방법 1

1. 50~500mg의 샘플을 교반 막대가 딸린 35mL 바이알에 넣습니다.
2. 분해관을 빙점조에 넣고 15분 정도 기다립니다.
3. 냉각시킨 후 5mL의 퍼포믹산을 넣습니다.
4. 유리 스토퍼로 튜브를 덮고 자력 교반기에서 15분 동안 저속으로 교반합니다.
5. 분해관을 빙점조에 다시 넣고 16시간 동안 산화 처리합니다.
6. 유리 스토퍼를 제거한 후 0.84g의 메타중아황산나트륨을 넣어 퍼포믹산을 분해합니다.
7. 섹션 5.4.2 산성 가수분해의 방법 1, 2단계부터 산성 가수분해를 실시합니다.

방법 2

1. 50~500mg의 샘플을 교반 막대가 딸린 35mL 바이알에 넣습니다.
2. 갓 전처리한 퍼포믹산 용액(9:1 포름산:30% 과산화수소) 6mL를 추가합니다.
3. 반응 혼합물을 50°C로 설정된 수조에서 한 시간 동안 인큐베이션합니다.
4. 50°C로 설정된 증발기에서 남은 퍼포믹산 용액을 완전히 건조시킵니다.
5. 섹션 5.4.2 산성 가수분해의 방법 1, 2단계부터 산성 가수분해를 실시합니다.

방법 1: 50~300mg 샘플

1. 샘플을 교반 막대가 딸린 35mL 바이알에 넣습니다.
2. 페놀을 중량 기준으로 3% 추가합니다.
3. 5mL의 6N HCl을 추가합니다.
4. 바이알 마개를 닫습니다.
5. Dynamic Method Control을 이용하여 Method 프로그램을 300W, 15분 유지, 195°C, 300psi로 설정합니다. 교반은 높음으로 설정해야 합니다.
6. 바이알을 Discover Cavity에 놓고 Start Key를 눌러 Method를 시작합니다.
7. 샘플은 250psi(±10%) 이하에서 195°C로 가열해야 합니다.

방법 2: 300~500mg 샘플

1. 샘플을 교반 막대가 딸린 35mL 바이알에 넣습니다.
2. 페놀을 중량 기준으로 3% 추가합니다.
3. 10mL의 6N HCl을 추가합니다.
4. 바이알 마개를 닫습니다.
5. Dynamic Method Control을 이용하여 Method 프로그램을 300W, 15분 유지, 195°C, 300psi로 설정합니다. 교반은 높음으로 설정해야 합니다.
6. 바이알을 Discover Cavity에 놓고 Start Key를 눌러 Method를 시작합니다.
7. 샘플은 250psi(±10%) 이하에서 195°C로 가열해야 합니다.

방법 1: 50~300mg 샘플

1. 샘플을 교반 막대가 딸린 35mL 바이알에 넣습니다.
2. 5mL의 4N NaOH를 추가합니다.
3. 바이알 마개를 닫습니다.
4. Dynamic Method Control을 이용하여 Method 프로그램을 300W, 15분 유지, 195°C, 300psi로 설정합니다. 교반은 높음으로 설정해야 합니다.
5. 바이알을 Discover Cavity에 놓고 Start Key를 눌러 Method를 시작합니다.
6. 샘플은 250psi(±10%) 이하에서 195°C로 가열해야 합니다.

방법 2: 300~500mg 샘플

1. 샘플을 교반 막대가 딸린 35mL 바이알에 넣습니다.
2. 10mL의 4N NaOH를 추가합니다.
3. 바이알 마개를 닫습니다.
4. Dynamic Method Control을 이용하여 Method 프로그램을 300W, 15분 유지, 195°C, 300psi로 설정합니다. 교반은 높음으로 설정해야 합니다.
5. 바이알을 Discover Cavity에 놓고 Start Key를 눌러 Method를 시작합니다.
6. 샘플은 250psi(±10%) 이하에서 195°C로 가열해야 합니다.

온도와 시간, 출력 설정은 가수분해 대상 샘플의 유형에 따라 달라집니다. 마이크로웨이브가 절차가 마무리될 때까지 계속 작동하게 하는 것이 중요합니다. 이를 위해서는 사용자가 이 기법으로 샘플을 최적화하는 실험을 해야 할 수도 있습니다.

위에서 설명한 절차에서 샘플 크기와 부피, 용기를 알맞게 선택해야 합니다. 가수분해가 적절히 이루어지도록 하기 위해 대단히 중요한 요소입니다. 샘플의 구성 성분 중에는 가수분해 후 고체상에 남아 있는 것이 있으며, 이것은 그림 9와 같이 프로세스 중에 검게 변합니다. 이 현상은 정상이며 아미노산은 용액 속에 있습니다. CEM 장비의 사용과 관련된 사항은 이메일(molecular.support@cem.com) 또는 전화(1-704-821-7015)로 CEM Corporation 분자샘플전처리팀(Molecular Sample Preparation Team)에 직접 문의하십시오.