아미노산 가수분해와 분석 종합 가이드

식품과 사료에는 성장과 영양에 필수적인 아미노산을 함유한 화학적 화합물이 들어 있습니다. 적절한 영양을 위해서는 아미노산 함량을 분석하는 것이 중요합니다. 그러나 이들 제품은 벌크 공정을 통해 생산됩니다. 벌크 공정은 의약품 제조와 마찬가지로 같은 생산 회차 안에서도 산출량이 다릅니다. 대표적인 샘플을 선택할 때에는 이 점을 고려해야 합니다. 일반적으로는 서브샘플링이 필요합니다. 이들 제품의 아미노산을 분석할 때에는 여러 가지 방법을 동원하여 샘플을 정확히 분석하고 단백질의 총 조성을 파악해야 합니다. 식품과 사료는 벌크 상태로 생산되고 단백질이 아닌 성분도 들어 있으므로 액체 가수분해를 권장합니다.

주의: 황 함유 아미노산 시스테인과 메티오닌, 아미노산 트립토판은 표준 산성 가수분해에서 안정적이지 않습니다. 이들 아미노산을 제대로 분석하려면 다른 방법을 적용해 보는 것도 좋습니다.

이번 섹션에서는 다음 세 가지 가수분해 절차를 소개합니다.

• 산성 가수분해 - 총 단백질 함량과 조성을 측정합니다.
• 퍼포믹산 산화 - 황 함유 아미노산 시스테인과 메타오닌을 측정합니다.
• 알칼리성 가수분해 - 트립토판 회수율을 평가합니다.

단백질에 결합되어 있는 아미노산을 분석할 때에는 (그림 1과 같이) 펩타이드 결합을 끊어 분석이 가능한 아미노산을 방출시켜야 합니다. 가수분해할 사료 단백질 샘플의 경우, 샘플 물질의 pH와 고체의 존재를 고려해야 합니다 앞 섹션에서 설명했듯이 가수분해의 속도나 범위는 단백질에 포함되어 있는 아미노산별로 다릅니다. 식품 물질 안에 결합되어 있는 단백질은 특히 더 그렇습니다. 어떤 가수분해 방법이든 파라미터는 면밀한 실험을 거친 후에 선택해야 합니다.

사료를 분석할 때에는 다음과 같은 샘플 전처리 요소를 고려해야 합니다.

1. 샘플 처리
2. 가수분해하는 샘플의 양
3. 가수분해에 사용되는 산의 부피

3.2.1 샘플 처리

사료 곡물과 유사 샘플은 대개 고르지 않습니다. 최대한 고르게 하려면 샘플을 고운 가루로 갈아야 합니다. 지방이 많이 함유된 샘플은 표준 절차로 지방을 제거한 후에 갈아도 됩니다. 입자가 고우면 사료 단백질의 효과적인 가수분해가 가능해 집니다. AOAC Method(4.1.11, 994.12b, J.AOAC Int. 88, 2005, Amino Acid Analysis of Feeds)에서는 샘플이 0.25mm 또는 60 메시(입자 크기 250µm)를 통과할 때까지 갈아야 합니다.

3.2.2 샘플량

사료 속 아미노산을 분석하는 AOAC Method에서는 다음 계산법을 이용하여 사료 분석에 사용될 샘플의 양을 측정합니다.

사용할 시험 분량은 다음과 같이 근사치로 계산합니다.

Ws = 1000/Ns

여기서 Ns = 시험 분량의 질소 함량(%)이며 Ws = 10mg 질소 함량에 해당하는 시험 물질의 중량(mg)입니다.

일반적으로 이것은 분석 대상 샘플 각각에 대해 물질 100~1000mg 범위에 속합니다.

3.2.3 산의 부피

앞서 지적했듯이 단백질 샘플을 효과적으로 가수분해하려면 대규모 산의 중량이 충분히 과량이어야 합니다. 사료도 마찬가지입니다. 다만 AOAC Method 994.12에서는 섹션 2.1.2와 같은 100배 초과량은 아니며 샘플 중량에 추가되는 산 중량의 비는 50~500배 정도입니다. 범위가 이 정도이고 사료 안에 비단백질 입자 물질이 다량으로 들어 있기 때문에 사료 분석을 일상적으로 이용하기 전에 범위를 찾는 연구를 면밀하게 진행해야 합니다.

3.2.4 내부 표준물질

샘플 속 아미노산별 가수분해의 편차를 보상하는 가장 좋은 방법은 내부 표준물질(IS)을 이용하는 것입니다. Waters에서는 UPLC에서 AccQ•Tag Ultra를 이용할 때에는 IS로 노르발린(Nva)을, HPLC에서 AccQ•Tag를 이용할 때에는 IS로 알파-아미노뷰티르산(AABA) 또는 노르루신을 권장합니다. AOAC Method 994.12에서 사료 분석용으로 권장하는 내부 표준물질은 노르루신입니다. IS를 선택할 때에는 크로마토그래피의 아미노산 피크 간에 원하는 분리능이 나오도록 주의를 기울여야 합니다.

3.2.5 AOAC 994.12 Amino Acids in Feeds

문헌에는 사료 속 아미노산을 분석할 때 이용할 만한 여러 가지 Method가 나와 있습니다. 여기 소개하는 Method는 AOAC Method 994.12 Amino Acids in Feeds를 기반으로 한 것입니다.

• 분석 저울, 눈금 ±0.1mg
• 저울, 위에 로딩
• 병, 50mL, 폴리에틸렌
• 분해 튜브, 증류 플라스크가 적합
• 분해 블록, 가열 맨틀 또는 수조가 적합
• 필터 장치, 0.22µm(Millex GS, Millipore 적합)
• pH 측정기, pH 2.0, 4.0, 7.0 완충액으로 검량
• 환류 냉각기
• 회전 증발기
• 유리 비커, 250mL, 1000mL
• 삼각 플라스크, 150mL
• 라운드 바텀(환저) 플라스크, 1000mL
• 눈금 실린더, 100, 500, 1000mL
• 용량 플라스크, 1000mL
• 홀 피펫, 10mL, 20mL
• 소결 유리 필터, 공극 10–15µm
• 실린지

• DL-노르루신, 결정질
• 염산, 농축액
• 수산화나트륨, 30% 용액(30g/100mL)
• 페놀, 결정질
• 티오다이글라이콜, 98% 용액
• 구연산나트륨
• pH 완충액, pH 2.0, 4.0, 7.0

구연산나트륨 완충액 - pH 2.20

1. 19.60g의 구연산나트륨을 1000mL 비커에 넣습니다.
2. 약 800mL 물(H₂O)에 용해시킵니다.
3. 저으면서 98% 티오다이글라이콜 10mL와 HCl 15mL를 넣습니다.
4. 용액을 1000mL 용량 플라스크로 옮긴 후 표시선까지 물(H₂O)로 희석합니다.
5. 완충액 용액이 소결 유리 필터를 통과하게 합니다.
6. HCl 또는 2M NaOH를 넣어 pH 2.20으로 맞춥니다.

6M HCl–페놀 용액

1. 1000mL 비커를 저울에 올려 영점조정을 한 뒤 1g의 결정질 페놀을 넣습니다.
2. 결정질 페놀을 500mL의 물(H₂O)에 용해시킵니다. 저으면서 500mL의 HCl을 천천히 붓습니다.

염산 용액 - 1M

1. 약 800mL 물(H₂O)을 1000mL 용량 플라스크에 붓습니다.
2. 피펫으로 83.3mL의 HCl을 추가합니다.
3. 표시선까지 물(H₂O)로 희석하고 골고루 섞습니다.

염산 용액 - 0.1 M

1. 약 800mL 물(H₂O)을 1000mL 용량 플라스크에 붓습니다.
2. 피펫으로 100mL의 1M HCl을 추가합니다.
3. 표시선까지 물(H₂O)로 희석하고 골고루 섞습니다.

수산화나트륨 용액(2M NaOH)

1. 1000mL 비커를 저울에 올려 영점조정을 한 뒤 80.0g의 NaOH를 넣습니다.
2. 비커에 약 600mL 물(H₂O)을 넣고 펠렛을 천천히 용해시킵니다.
3. 용액을 냉각한 후 1000mL 용량 플라스크로 옮깁니다.
4. 표시선까지 물(H₂O)로 희석하고 골고루 섞습니다.

내부 표준물질 용액

1. DL-노르루신 결정 195~200mL을 정확히 계량해 (저울에 올려 영점조정을 한) 150mL 삼각 플라스크에 넣습니다.
2. 100mL의 1M HCl로 희석합니다.
3. 용액을 1000mL 용량 플라스크로 옮긴 후 표시선까지 물(H₂O)로 희석합니다.

1. 시험 샘플 100~1000mg을 0.1mg(질소 함량 10mg에 해당)까지 곱게 간 후 라벨이 붙어 있는 분해 튜브에 넣습니다. 앞 섹션의 계산법에 따라 실제 사용할 샘플의 양을 구합니다.
2. 6M HCl-페놀 용액 50mL을 계량 부분에 넣고 살짝 젓습니다. 용액에 끓임쪽을 2~3개 넣습니다.
3. 흄(fume) 후드에서 히팅 블록이나 온도로 평형을 맞춘 수조를 사용하여 110–120°C에서 24시간 동안 환류 상태에서 가수분해합니다.
4. 분해 튜브에서 열원을 치운 후 상온으로 식힙니다.
5. 홀 피펫으로 노르루신 내부 표준물질 용액 20mL을 각 시험 용액에 추가합니다. 플라스크를 흔들어 용액을 골고루 섞습니다.
6. 가수분해물이 소결 유리 필터를 통과하게 하여 1000mL 라운드 바텀(환저) 플라스크에 넣습니다.
7. 플라스크를 회전 증발기에 연결한 후 60°C에서 건조될 때까지 증발시킵니다.
8. 약 20mL의 물(H₂O)을 넣어 세척한 후 증발을 반복합니다. 세척과 증발을 2회 반복합니다.
9. 증발기에서 플라스크를 떼어냅니다.
10. 증발된 가수분해물에 구연산나트륨 완충액 50mL를 넣은 후 50mL 폴리에틸렌 병으로 옮깁니다.
11. 그러면 샘플은 유도체화를 할 준비가 되었습니다.

시스테인과 메티오닌은 사료 물질을 분석할 때 중요한 아미노산입니다. 둘 다 사료를 먹는 동물의 성장을 제한하는 역할을 합니다. 표준 산성 가수분해 조건은 이 두 아미노산에 유효하지 않기 때문에 퍼포믹산을 이용하는 다른 산화 방법을 많이 이용합니다. 이 방식에서는 먼저 (그림 3과 같이) 시스테인과 시스틴을 시아누르산으로, 메티오닌은 메티오닌술폰으로 변환합니다. 그런 다음 샘플을 산성 가수분해하여 효과적으로 유도체화합니다.

문헌에는 퍼포믹산 산화 방법이 몇 가지 버전으로 나와 있습니다. 전체 프로세스는 비슷하지만 세부 항목은 다릅니다. 본 지침서에서는 일단 두 가지만 소개합니다. 하나는 AOAC 994.12이고 다른 하나는 MacDonald 등(1985)이 제안한 방법입니다. 방법을 선택하기 전에 면밀하게 평가하고 최적화해야 합니다.

• 분석 저울, 눈금 ±0.1mg
• 저울, 위에 로딩
• 병, 50mL, 폴리에틸렌
• 분해 튜브, 증류 플라스크가 적합
• 분해 블록, 가열 맨틀 또는 수조가 적합
• 필터 장치, 0.22µm(Millex GS, Millipore 적합)
• pH 측정기, pH 2.0, 4.0, 7.0 완충액으로 검량
• 환류 냉각기
• 회전 증발기
• 유리 비커, 250mL, 1000mL
• 삼각 플라스크, 150mL
• 라운드 바텀(환저) 플라스크, 1000mL
• 눈금 실린더, 100, 500, 1000mL
• 용량 플라스크, 1000mL
• 홀 피펫, 10mL, 20mL
• 소결 유리 필터— 공극 10–15µm
• 빙점조
• 실린지

• 포름산, 88%
• 과산화수소, 30%
• 메타중아황산나트륨
• DL-노르루신, 결정질
• 염산, 농축액
• 수산화나트륨, 30% 용액(30g/100mL)
• 페놀, 결정질
• 티오다이글라이콜, 98% 용액
• 구연산나트륨
• pH 완충액, pH 2.0, 4.0, 7.0

구연산나트륨 완충액—pH 2.20

1. 19.60g의 구연산나트륨을 1000mL 비커에 넣습니다.
2. 약 800mL 물(H₂O)에 용해시킵니다.
3. 저으면서 98% 티오다이글라이콜 10mL와 HCl 15mL를 넣습니다.
4. 용액을 1000mL 용량 플라스크로 옮긴 후 표시선까지 물(H₂O)로 희석합니다.
5. 완충액 용액이 소결 유리 필터를 통과하게 합니다.
6. HCl 또는 2M NaOH를 넣어 pH 2.20으로 맞춥니다.

6M HCl–페놀 용액

1. 1000mL 비커를 저울에 올려 영점조정을 한 뒤 1g의 결정질 페놀을 넣습니다.
2. 결정질 페놀을 500mL의 물(H₂O)에 용해시킵니다. 저으면서 500mL의 HCl을 천천히 붓습니다.

염산 용액 - 1M

1. 약 800mL 물(H2O)을 1000mL 용량 플라스크에 붓습니다.
2. 피펫으로 83.3mL의 HCl을 추가합니다.
3. 표시선까지 물(H₂O)로 희석하고 골고루 섞습니다.

염산 용액 - 0.1 M

1. 약 800mL 물(H2O)을 1000mL 용량 플라스크에 붓습니다.
2. 피펫으로 100mL의 1M HCl을 추가합니다.
3. 표시선까지 물(H₂O)로 희석하고 골고루 섞습니다.

수산화나트륨 용액(2M NaOH)

1. 1000mL 비커를 저울에 올려 영점조정을 한 뒤 80.0g의 NaOH를 넣습니다.
2. 비커에 약 600mL 물(H₂O)을 넣고 펠렛을 천천히 용출합니다.
3. 용액을 냉각한 후 1000mL 용량 플라스크로 옮깁니다.
4. 표시선까지 물(H₂O)로 희석하고 골고루 섞습니다.

내부 표준물질 용액

1. DL-노르루신 결정 195~200mL을 정확히 계량해 (저울에 올려 영점조정을 한) 150mL 삼각 플라스크에 넣습니다.
2. 100mL의 1M HCl로 희석합니다. 용액을 1000mL 용량 플라스크로 옮긴 후 표시선까지 물(H₂O)로 희석합니다.

퍼포믹산 시약

1. 후드 안에서 준비합니다. 25mg의 결정질 페놀을 25mL 시험관에 넣습니다.
2. 마이크로 피펫으로 0.5mL의 30% H₂O₂를 넣습니다.
3. 4.5mL의 88% 포름산 용액을 넣습니다.
4. 시험관을 스토퍼로 덮은 후 혼합물을 상온에 30분간 그대로 둡니다.
5. 30분 후 시험관을 빙점조에 넣고 15분간 퍼포믹산 혼합물을 냉각시킵니다.
6. 시약은 사용하기 직전에 만듭니다.

1. 100~1000mg의 시험 샘플을 0.1mg(질소 함량 10mg에 해당)까지 곱게 간 후 라벨이 붙어 있는 가수분해 튜브에 넣습니다. 앞서 설명한 계산법에 따라 실제 사용할 샘플의 양을 구합니다.
2. 각 튜브에 자석 교반기를 넣은 후 가수분해 튜브를 빙점조(0°C)에 놓습니다.
3. 퍼포믹산과 시험 분량을 모두 15분 이상 냉각한 후에 각 가수분해 튜브에 퍼포믹산 시약을 5mL 넣습니다. 모든 튜브를 막거나 마개를 씌우고 15분 동안 젓습니다.
4. 분해 튜브를 빙점조에 다시 넣고 샘플을 16시간 동안 산화합니다.
5. 유리 스토퍼를 제거한 후 약 0.84g의 메타중아황산나트륨을 넣어 퍼포믹산을 분해합니다. 15분 동안 저어 SO₂를 유리시킵니다.
6. 이제 샘플에 대해 산성 가수분해를 해도 됩니다.

1. 6 N HCl– 페놀 용액 50mL을 계량 부분에 넣고 살짝 젓습니다. 용액에 끓임쪽을 2~3개 넣습니다.
2. 흄(fume) 후드에서 히팅 블록이나 온도로 평형을 맞춘 수조를 사용하여 110–120°C에서 24시간 동안 환류 상태에서 가수분해합니다.
3. 분해 튜브에서 열원을 치운 후 상온으로 식힙니다.
4. 홀 피펫으로 노르루신 내부 표준물질 용액 20mL을 각 시험 용액에 추가합니다. 플라스크를 흔들어 용액을 골고루 섞습니다.
5. 아래 단계 a-d 또는 e-g를 진행합니다.
   1. 가수분해물이 소결 유리 필터를 통과하게 하여 1000mL 라운드 바텀(환저) 플라스크에 넣습니다.
   2. 플라스크를 회전 증발기에 연결하고 진공 상태에서 0.5mL이 될 때까지 40°C로 증발시킵니다. 주의: 용액이 완전히 증발해 버리면 안 됩니다.
   3. 증발기에서 플라스크를 떼어냅니다.
   4. 증발된 가수분해물에 구연산나트륨 완충액 50mL를 넣은 후 50mL 폴리에틸렌 병으로 옮깁니다.
   5. 가수분해물이 소결 유리 필터를 통과하여 250mL 진공 플라스크로 흐르게 합니다. 여과액을 250mL 비커로 옮깁니다.
   6. 비커를 빙점조에 놓습니다.
   7. 저으면서 약 40mL의 7.5M NaOH로 가수분해물을 중화합니다. (주의: 온도는 40°C를 넘지 않아야 합니다.) 2M NaOH로 pH를 2.20로 조절하십시오.

     6. 그러면 샘플은 유도체화를 할 준비가 되었습니다.

주의: 문헌에는 이 분석이 여러 가지 이름으로 나와 있습니다. 퍼포믹산과 브롬화 수소의 양, 증발 온도에 대해서도 의견이 분분합니다. 양 및/또는 온도를 바꾸면 7단계의 증발 시간도 달라집니다.

• 25 x 150mm 가수분해 튜브(마개 포함)
• 얼음과 빙점조
• 홀 피펫
• 진공 증발기
• 깨끗한 질소원
• 오븐 또는 히팅 블록
• 용량 글래스웨어
• 퍼포믹산
• 과산화수소
• 포름산
• 초순수
• HBr 용액, 48% 중량별

1. 30% 과산화수소 1부피를 88% 포름산 9부피와 혼합합니다.
2. 혼합물을 한 시간 동안 그대로 둡니다. 중간에 자주 저어 줍니다.
3. 혼합물을 빙점조에 30분 동안 두었다가 즉시 사용합니다.

1. 20mg(mg 단위로 반올림) 단백질에 상응하는 샘플을 25 x 150mm 튜브에 넣습니다.
2. 샘플을 빙점조에 30분 동안 넣어 둡니다.
3. 냉각시킨 퍼포믹산 10mL를 샘플에 넣은 후 부드럽게 흔들고 테플론 라인 캡으로 닫습니다.
4. 샘플을 (얼음으로 뒤덮여 있는 상태로) 냉장고에 넣고 0°C로 하루(16시간) 동안 그대로 둡니다.
5. 16시간 후 샘플이 0°C를 유지하는 가운데 옥탄올 세 방울과 찬 48% HBr 3mL를 추가하고 샘플을 천천히 흔들어 줍니다. 위 작업은 후드 안에서 해야 합니다. 샘플을 0°C에서 30분 동안 그대로 둡니다.
6. 진공 증발기로 37°C에서 마를 때까지 증발시킵니다. 이 작업은 1~2시간 걸립니다.
7. 6N HCI 5mL를 튜브에 넣습니다. 질소로 30초 동안 퍼지한 후 즉시 뚜껑을 닫습니다.
8. 샘플을 110°C 오븐에 24시간 동안 넣어 둡니다.
9. 오븐에서 꺼내 식힙니다.
10. 작업 내부 표준물질 10mL(5.0µmol/mL)을 넣은 후 골고루 섞습니다. 참고: 사용하는 내부 표준물질의 실제 농도를 계산하여 기기에 주입할 때 같은 양을 맞춰야 합니다.
11. 샘플을 250mL 용량 플라스크에 정량 트랜스퍼한 후 샘플 튜브를 HPLC 등급 물로 헹구고 플라스크의 표시선까지 물로 채웁니다.
12. 12단계의 샘플 약 1mL를 0.45µm 샘플 필터로 필터링합니다. 유도체화를 바로 하지 않는다면 샘플에 뚜껑을 덮어 냉장고에 보관합니다. 참고: 필터링 절차 대신 원심분리를 해도 됩니다. 투명한 상청액이 얻어질 때까지 원심분리를 하십시오.

산성 가수분해 표준 조건에서는 트립토판(Trp)이 불안정하여 효과적으로 분석되지 않습니다. 사료 속 아미노산이 방출되어 분석이 가능하도록 염기 가수분해라는 방법을 이용해야 합니다. 이 방법에서는 4.2M NaOH을 사용해 단백질을 가수분해합니다. 이 방법은 마직막에 유도체화 단계가 필요 없다는 장점이 있습니다. 280nm UV 검출을 이용하는 기기 분석만 하면 됩니다.

여기 소개하는 절차는 AOAC Method 988.15 Tryptophan in Foods and Food and Feed Ingredients을 각색한 것입니다.

• 변형 마이크로 킬달 플라스크(Ace Glass 제품) - 25mL 마이크로 킬달 플라스크, 내경 12mm, 15cm 긴 목. 목은 내경 약 6mm까지 수축, 플라스크 벌브 위 5cm
• 진공 펌프
• 멤브레인 필터 장치와 0.45µm 필터
• 드라이아이스
• 수조
• 수조용 에탄올
• 홀 피펫과 글래스웨어
• pH 측정기

• Milli-Q 시스템(Millipore Corp)을 정제한 물, 또는 동등한 물
• 4.2 M NaOH
• 1-옥탄올
• pH 4.25 구연산나트륨 완충액
• HCl
• 트립토판 표준물질 용액
  • 스톡 용액 - 1mg/mL. 250mg L-트립토판을 물(H₂O) 100mL에 용해시킨 후 HCl 여섯 방울을 떨어뜨립니다. 물(H₂O)을 사용하여 250mL로 희석합니다.
  • 작업 용액 - 0.1mg/mL. 10mL 스톡 용액을 물(H₂O)을 사용하여 100mL가 될 때까지 희석합니다.
  • 작업 용액 II—0.04mg/mL. 4mL 스톡 용액을 물(H₂O)을 사용하여 100mL가 될 때까지 희석합니다.
  • 사용하지 않을 때에는 표준물질 용액을 냉장고에 보관합니다. 매달 새 용액을 준비합니다.

1. 실험실 샘플을 1mm 스크린이 있는 원심 분쇄기에 넣고 갈아 골고루 섞습니다.
2. 단백질 100mg이 들어가도록 시험 분량을 계량해 변형 마이크로 킬달 플라스크에 넣습니다.
3. 지질이 5%를 초과하는 시험 샘플:
   1. 중량을 잰 시험 분량이 들어 있는 플라스크에 석유 에테르 10mL을 넣습니다.
   2. 부드럽게 흔들어 섞고 20분 동안 초음파 처리합니다. 가라앉도록 내버려 둡니다. 필요하면 원심분리를 합니다.
   3. 석유 에테르를 최대한 사이펀합니다. 이때 고체가 빠져 나가지 않도록 주의합니다.
   4. 부드럽게 흐르는 N₂ 아래에서 남은 석유 에테르를 증발시킵니다. 이어서 가수분해를 실시합니다.
4. 지질이 5%에 미달하는 시험 샘플: 가수분해를 실시합니다.

1. N₂로 10분 동안 버블링하여 4.2M NaOH에서 기포를 제거합니다.
2. 각 플라스크에 기포가 빠진 4.2M NaOH 10mL을 넣습니다.
3. 1-옥탄올 세 방울을 떨어뜨립니다.
4. 처리한 용액을 즉시 드라이아이스/에틸알코올 수조에 넣어 냉동시킵니다. 그 후 플라스크를 수조에서 뺀 후 10mm로 배출합니다.
5. 진공을 끄고 플라스크를 밀봉합니다.
6. 밀봉한 플라스크를 상온에서 물(H₂O)이 담긴 비커에 넣고 시험 용액이 녹기를 기다립니다.
7. 플라스크를 110°C 오븐에 20시간 동안 넣어 둡니다.
8. 플라스크를 상온으로 식힙니다.
9. 플라스크 목을 pH 4.25 구연산나트륨 완충액 1mL로 헹굽니다. 헹군 액체는 비커에 모아 둡니다.
10. 가수분해물을 같은 50mL 비커로 정량 트랜스퍼합니다. 이때 pH 4.25 구연산나트륨 완충액 용액 두 분량으로 플라스크를 헹궈 냅니다.
11. 용액을 3.5mL의 HCl로 중화한 후 강하게 젓습니다. pH를 4.25 ± 0.05로 맞춥니다.
12. 용액을 25mL 용량 플라스크에 정량 트랜스퍼한 후 물(H₂O)로 희석합니다.
13. 용액을 40mL 원심분리 튜브에 넣고 1150g에서 20분 동안 원심분리합니다.
14. 유리 필터 종이(Whatman GF/A)로 상청액을 필터링합니다.
15. 여과액을 원심분리 튜브에 옮기고 23,000G에서 10분 동안 원심분리합니다.

주의: 여기서는 유도체화하지 않고 상청액 한 분량을 UV(289nm) 분석해도 됩니다.