O primer de Espectrometria de Massas

Ionização de elétrons (EI, Electron Ionization)

Muitos estão familiarizados com a ionização de elétrons (EI, Electron Ionization).(Ocasionalmente, a expressão anterior "impacto de elétrons" é utilizada, embora, tecnicamente, esteja incorreta). A EI, geralmente realizada expondo uma amostra a elétrons de 70 eV, é conhecida por ser uma técnica "difícil". A energia dos elétrons que interagem com a molécula de interesse é geralmente muito maior do que a contida em suas ligações, por isso, ocorre a ionização. O excesso de energia quebra as ligações de uma forma bem caracterizada. O resultado são fragmentos previsíveis e identificáveis dos quais podemos deduzir a identidade da molécula. A abstração de apenas um elétron da camada externa produz um cátion radical no modo positivo (M.+) e um rico espectro de fragmentos. Ao contrário das técnicas de ionização atmosférica "mais suaves", que produzem uma resposta espectral, às vezes característica do projeto da fonte específica do fabricante, a técnica de EI é bastante independente do projeto da fonte. Um espectro produzido por um equipamento de EI se parece muito com um espectro do mesmo composto de outro equipamento de EI, um fato que se presta à criação de bibliotecas espectrais para combinar desconhecidos com espectros de referência.

Ionização química (CI, Chemical Ionization)

Moléculas que se fragmentam excessivamente exigem técnicas "suaves". A ionização química (CI, Chemical Ionization) produz íons por um processo de transferência de prótons mais suave que preserva e promove a aparência do próprio íon molecular. A amostra é exposta a um excesso de gás reagente, como aquele que evolui quando o metano forma o íon molecular protonado (M+H). O processo inverso pode produzir íons negativos. Transferir o próton para a molécula de gás pode, em alguns casos, produzir o íon negativo (M-H).

A ionização química (CI, Chemical Ionization), às vezes, é utilizada para compostos com química semelhante àqueles analisados por EI para melhorar a abundância ou aparência do íon molecular em favor de uma fragmentação significativa. Semelhante à EI, as amostras devem ser termicamente estáveis, pois o aquecimento na fonte causa vaporização. O mecanismo de ionização da CI depende da EI para a etapa de ionização inicial, mas, dentro da fonte, há um gás reagente químico, como metano, isobutano ou amônia, em alta pressão. O gás reagente, que está presente em uma concentração muito mais alta do que o analito (R), é ionizado por ionização de elétrons para produzir íons reagentes primários R+. . A colisão dos íons R+. com moléculas R neutras leva à formação de íons secundários estáveis, que são as espécies reagentes que ionizam as moléculas do analito (A) por meio de reações íon-molécula.

Por exemplo, a reação íon-molécula entre um íon de metano e uma molécula de metano dá origem às espécies CH₅⁺ razoavelmente estáveis.

CH₄^+. + CH₄  --> CH₅⁺ + CH₃^.

O íon reagente CH₅⁺ pode ionizar moléculas de analito neutro (A) por transferência de prótons, abstração de hidretos ou troca de carga.

RH⁺ + A --> R + AH⁺ (transferência de prótons)

(R-H)⁺ + A --> R + (A-H)⁺ (abstração de hidretos)

R+^. + A --> R + A^+. (troca de carga)

As reações de ionização mais comuns são a protonação, que é favorecida para moléculas com afinidades de prótons maiores do que as do reagente. A abstração de hidretos é comum para moléculas de menor afinidade de prótons, e a troca de carga ocorre com reagentes de alta energia de ionização.

A substância a ser analisada está a uma pressão muito mais baixa do que o gás reagente. Se considerarmos o metano como o gás reagente, o impacto de elétrons causa principalmente a ionização do metano. Ele se fragmenta em parte no CH₃⁺. Então, essas espécies sofrem reações de moléculas de íons sob as altas pressões da fonte empregadas.

CH₄^+. + CH₄  --> CH₅⁺ + CH₃^.

CH₃⁺ + CH₄  --> C₂H₅⁺ + H₂

O CH₅⁺ pode atuar como um ácido de Bronsted, e o C₂H₅⁺ como um ácido de Lewis para produzir íons a partir do analito.

A escolha cuidadosa do gás reagente de CI pode melhorar a transferência de carga para uma molécula de analito, pois a acidez da fase gasosa do gás de ionização química influencia a eficiência da transferência de carga. Em CI, é mais provável que o analito resulte em um íon molecular com a fragmentação reduzida conservando a energia normalmente internalizada em EI para quebrar as ligações.

Ionização química de íon negativo (NCI, Negative Ion Chemical Ionization)

Uma variação, ionização química negativa (NCI, Negative Chemical Ionization), pode ser realizada com um analito que contenha frações de captura de elétrons (por exemplo, átomos de flúor ou grupos de nitrobenzila). A sensibilidade pode ser aumentada muitas vezes (relatada como sendo de 100 a 1000 vezes maior em alguns casos) do que a de EI. A NCI é aplicável a uma grande variedade de moléculas pequenas que são (ou podem ser) modificadas quimicamente para promover a captura de elétrons.

No íon negativo, existem dois mecanismos principais pelos quais os íons negativos são produzidos: a captura de elétrons e a ionização química do íon reagente. Sob condições de CI, as moléculas eletronegativas podem capturar elétrons térmicos para gerar íons negativos. A ionização química de íon negativo verdadeiro ocorre pela reação de um composto de analito (AH) com íons reagentes carregados negativamente (R^-. ou R^-). Vários tipos de reações íon-molécula podem ocorrer, sendo a mais comum a abstração de prótons.

AH + R^-  --> A^- + RH

À medida que a afinidade (basicidade) de prótons do íon reagente aumenta, é mais provável que ocorra a abstração de prótons.

Cromatografia a gás (GC, Gas Chromatography)

Talvez, para muitos, o primeiro contato com um espectrômetro de massas seja como o detector para um cromatógrafo a gás. A variedade de tipos de equipamentos de GC-MS foi expandida para transcender as limitações de projetos de equipamentos anteriores ou para atender à legislação cada vez mais rigorosa em aplicações como análise ambiental, screening de segurança alimentar, metabolômica e aplicações clínicas, como análise forense, toxicologia e screening de medicamentos.

No passado, dois tipos de espectrômetros de massas dominavam a análise de GC-MS: os equipamentos de setor magnético e quadrupolo simples. O primeiro, que oferecia alta resolução e análises de massa acurada, era utilizado em aplicações que exigiam extrema sensibilidade. O último realizava análises de rotina de compostos-alvo.

As análises de GC-MS mais desafiadoras foram reservadas para equipamentos de setor magnético: dioxinas em amostras ambientais/industriais ou screening para a utilização ilegal de medicamentos para melhorar o desempenho em esportes competitivos. Os níveis de detecção de fentograma, em alta resolução/seletividade, são facilmente alcançados em equipamentos de setor magnético.

Logo após sua introdução, os sistemas de GC-MS quadrupolo ganharam aceitação em aplicações de análise de destino. Os métodos da USEPA determinaram a utilização de equipamentos de GC-MS quadrupolo para analisar amostras para numerosos contaminantes ambientais. Como essas aplicações exigem apenas níveis de detecção de picograma a nanograma, a sensibilidade mais baixa do quadrupolo em relação ao setor não era uma limitação. Pelo contrário, o custo muito reduzido, a facilidade de utilização e a portabilidade provaram ser grandes vantagens.

Cromatografia líquida (LC, Liquid Chromatography)

A tecnologia revolucionária que nos deu acesso analítico a cerca de 80% do universo químico inalcançável por GC também é responsável pelo crescimento fenomenal e pelo interesse na Espectrometria de Massas nas últimas décadas. Algumas pessoas são destacadas (consulte a seção sobre "Um breve histórico") por serem responsáveis pela associação de LC com MS. Começando indiscutivelmente na década de 1970, a LCMS como a conhecemos hoje atingiu a maturação no início da década de 1990. Muitos dos dispositivos e das técnicas que utilizamos hoje na prática são provenientes diretamente dessa época.

A cromatografia líquida foi definida no início dos anos 1900 pelo trabalho do botânico russo Mikhail S. Tswett. Seus estudos se concentraram na separação de pigmentos de folhas extraídos de plantas utilizando um solvente em uma coluna preenchida com partículas. Em sua forma mais simples, a cromatografia líquida baseia-se na capacidade de prever e reproduzir com grande precisão as interações concorrentes entre os analitos em solução (a fase móvel ou condensada) sendo passados sobre um leito de partículas preenchidas (a fase estacionária). O desenvolvimento de colunas preenchidas com uma variedade de metades funcionais nos últimos anos e os sistemas de fornecimento de solvente capazes de fornecer com precisão a fase móvel permitiram que a LC se tornasse a espinha dorsal analítica para muitos setores.

A sigla HPLC foi cunhada por Csaba Horváth em 1970 para indicar que a alta pressão era utilizada para gerar o fluxo necessário para cromatografia líquida em colunas preenchidas. Avanços contínuos em desempenho desde então, incluindo o desenvolvimento de partículas menores e maior seletividade, também viram o significado da sigla mudar para cromatografia líquida de alto desempenho.

Em 2004, outros avanços na tecnologia de equipamentos e colunas alcançaram aumentos significativos na resolução, na velocidade e na sensibilidade em cromatografia líquida. Colunas com partículas menores (1,7 mícron) e equipamentos com recursos especializados projetados para fornecer fase móvel a 15000 psi (1000 bar) passaram a ser conhecidos como tecnologia UPLC, representando o termo diferenciado de cromatografia líquida de altíssimo desempenho. Muito do que está incorporado nessa tecnologia atual foi previsto por pesquisadores, como John Knox nos anos 1970. Knox previu que os diâmetros ideais das partículas seriam de 1 ou 2 μm e a cromatografia seria termicamente sensível ao calor de fricção. Tecnologia capaz de desenvolver pequenas partículas uniformes e robustas foi necessariamente encontrada e resolvida no caminho para o desenvolvimento de UPLC para ser amplamente utilizada. Veja um bom primer básico sobre HPLC e UPLC.

Electrospray (ESI, ionização por electrospray)

O termo geral "ionização à pressão atmosférica" (API, Atmospheric Pressure Ionization) inclui a técnica mais notável, a ionização por electrospray (ESI, Electrospray Ionization), que por si só fornece a base para várias técnicas relacionadas capazes de criar íons à pressão atmosférica em vez de no vácuo. A amostra é dissolvida em um solvente polar (normalmente menos volátil do que aquele utilizado com GC) e bombeada através de um capilar de aço inoxidável que carrega entre 2000 e 4000 V. O líquido é aerolizado conforme sai do capilar à pressão atmosférica, as gotículas de dessolvatação expelindo íons que fluem para o espectrômetro de massas, induzido pelos efeitos combinados de atração eletrostática e vácuo.

O mecanismo pelo qual o potencial é transferido do líquido para o analito, criando íons, permanece um tópico de controvérsia. Em 1968, Malcolm Dole propôs pela primeira vez o mecanismo de resíduo de carga no qual ele formulou a hipótese de que, conforme uma gotícula evapora, sua carga permanece inalterada. A tensão superficial da gotícula, em última análise, incapaz de se opor às forças repulsivas da carga imposta, explode em muitas gotículas menores. Essas fissões coulômbicas ocorrem até que permaneçam gotículas contendo um único íon de analito. Quando o solvente evapora a partir da última gotícula, um íon de fase gasosa se forma.

Em 1976, Iribarne e Thomson propuseram um modelo diferente, o mecanismo de evaporação de íons, no qual pequenas gotículas se formam por fissão coulômbica, semelhante à forma como se formam no modelo de Dole. No entanto, de acordo com a teoria de evaporação de íons, a intensidade do campo elétrico na superfície da gotícula é alta o suficiente para fazer com que a saída da superfície da gotícula e a transferência direta para a fase gasosa sejam energeticamente favoráveis para íons solvatados.

É possível que os dois mecanismos possam realmente funcionar em conjunto: o mecanismo de resíduo de carga dominante para massas superiores a 3000 Da, enquanto a evaporação de íons é dominante para massas inferiores; consulte R Cole, Some tenets pertaining to Electrospray ionization mass spectrometry, J of Mass Spec, 35, 763–772 (2000).

O líquido do cromatógrafo líquido entra na probe de ESI em um estado de equilíbrio de carga. Portanto, quando o solvente sai da probe de ESI, ele carrega uma carga iônica líquida. Para garantir que a ESI seja uma técnica contínua, a solução deve ser carregada por reações eletroquímicas, por meio das quais os elétrons são transferidos para uma superfície condutora que atua como um eletrodo. Entre outros efeitos, esse processo pode levar a alterações do pH. Presume-se que, no modo positivo, gotículas com carga positiva deixem o spray, e os elétrons sejam aceitos pelo eletrodo (oxidação). (O inverso seria verdadeiro no modo negativo.) A área de superfície do eletrodo eletroativo, a amplitude da corrente e a natureza das espécies químicas e seus potenciais de eletrodo exercem um efeito.

Acima de tudo, a ESI é um processo eficiente. No entanto, a energia de ativação e a diferença de energia para a reação, no total, para espécies individuais, variam. A taxa de fluxo da solução e a corrente aplicada definem os limites para cada gotícula. Ocorre competição entre as moléculas, e a supressão de analitos de interesse não é incomum.

Extensões da teoria de ESI básica, como a redução do líquido a volumes extremamente baixos — por exemplo, para 30 nL/min no caso de nanospray — têm se mostrado eficazes, especialmente em estudos limitados de amostras de proteínas e aminoácidos.

Ionização química à pressão atmosférica (APCI, Atmospheric Pressure Chemical Ionization)

Embora o trabalho de demonstração de APCI tenha sido publicado em paralelo com o de demonstração de ESI, a APCI não foi amplamente adotada até que a ESI fosse comercializada, o que ocorreu após o trabalho de Fenn em 1985.

Horning introduziu a APCI pela primeira vez em 1973 para analisar compostos voláteis utilizando várias técnicas de introdução, uma das quais era HPLC. A capacidade auxiliar da APCI permite que os analitos resistam à conversão em íons de fase gasosa por ESI, os menos polares e mais voláteis introduzidos em um espectrômetro de massas a partir de um fluxo de fase condensada, ou líquido. Ao contrário da ESI, a APCI transfere analitos neutros para a fase gasosa por meio da vaporização do líquido introduzido em um fluxo de gás aquecido. A ionização química depende da transferência de espécies carregadas entre um íon reagente e uma molécula de destino para produzir um íon de destino que pode ser analisado em massa. Mais comumente, no modo de íon positivo, um aduto se forma entre a molécula de destino e o íon H⁺ pequeno, embora adutos com sais também sejam comuns. Por exemplo, o aduto de amônio pode se formar (M+NH₄)⁺ quando o sal de base fraca de ácido fraco, acetato de amônio, está presente na fase móvel, um modificador frequentemente utilizado no lugar do tampão de fosfato menos volátil e altamente iônico. Em concentrações mais altas de sal, a competição entre as formas protonada e amonizada pode produzir uma resposta diminuída para ambas. O número máximo de íons capazes de se formar por APCI é muito maior do que na ESI porque os íons reagentes se formam de maneira redundante. O líquido é empurrado através de um tubo não condutor, geralmente de vidro de sílica fundida, ao redor do qual flui um gás nebulizador. As gotículas finas resultantes colidem com a parede interna aquecida de um tubo ou probe que se estende além da extremidade do tubo não condutor e, portanto, são convertidas para a fase gasosa. Esse tipo de ionização é frequentemente realizado em velocidades lineares muito maiores do que as taxas de fluxo de HPLC ou de cromatografia líquida de altíssimo desempenho (UPLC, Ultra Performance Liquid Chromatography) normalmente associadas ao electrospray. No entanto, os equipamentos contemporâneos fornecem capacidades de dessolvatação muito maiores, melhorando o desempenho para todas as técnicas dependentes de aerossol.

As moléculas do analito dessolvatado são então ionizadas por meio de ionização química. O potencial ionizante é aplicado, não através do líquido como na ESI, mas na ponta de uma agulha como um plasma, ou corona, através da qual as gotículas passam. Na verdade, a fase móvel atua como um intermediário transferindo a carga para o analito. Assim, o primeiro nome foi APCI: "electrospray mediado por solvente".