O primer de Espectrometria de Massas

Quando um composto já é conhecido, como no caso de ensaios clínicos em que dados estatísticos de muitas amostras individuais são coletados e o medicamento administrado e seu metabólito de interesse já estão bem caracterizados, os espectros de massa completos não são necessários. No entanto, é necessária uma sensibilidade muito boa em uma mistura fisiológica complexa, de modo que o equipamento seja configurado para monitorar apenas valores específicos de m/z. (Consulte a comparação da resposta de SIR e MRM apresentada anteriormente neste primer).

Como os íons fluem continuamente através do tandem quadrupolo ou do triplo quadrupolo, não há necessidade de limitar a corrente de íons no analisador de massas. Por outro lado, a captura de íons tem um volume finito definido e, por isso, precisa de uma função para evitar que muitos íons entrem na captura. Não controlar a intensidade de íons resulta em picos indesejáveis ou inesperados em um espectro, um fenômeno particularmente problemático ao tentar pesquisar na biblioteca espectros de EI em GC-MS. O projeto das capturas de íons mudou substancialmente para permitir ionização externa (íons criados fora do filtro de massa com subsequente injeção de íons na captura) em vez de ionização interna (ionização dentro do filtro de massa). A alteração do projeto abordou o problema das reações das moléculas de íons na captura, mas também introduziu uma limitação. Mesmo no modo de MRM, esse controle automático da corrente de íons totais pode resultar em intervalos de amostragem irregulares em um pico cromatográfico. Portanto, em última análise, a captura de íons é limitada como uma ferramenta para análise de traços em matrizes complexas, especialmente quando a maior acurácia e precisão são necessárias, como é o caso, para dados que devem ser legalmente defensáveis ou cujos critérios rigorosos de acurácia e precisão da quantificação são ditados pela legislação.

Um padrão interno é normalmente utilizado ao realizar a quantificação por MS. O padrão fornece controles sobre a variabilidade nos processos de extração, injeção por LC e ionização. Sem um padrão interno, os RSDs entre as replicatas podem ser dez vezes maiores do que as replicatas referenciadas a um padrão que normalmente produz RSDs em baixos dígitos únicos. O melhor padrão interno é uma versão marcada isotopicamente da molécula de interesse. Embora a síntese dessa molécula seja cara, ela exibirá recuperação de extração, tempo de retenção cromatográfica e resposta de ionização semelhantes no espectrômetro de massas.

A avaliação da adequação do sistema, a randomização de amostras e a determinação de curvas e pontos de concentração adequados são assuntos de um longo debate. Algumas boas referências podem ser vistas em https://www.ionsource.com/tutorial/msquan/requantoc.htm.

Calibração

Os compostos de calibração são utilizados por um espectrometrista de massas para ajustar a escala de calibração de massas, bem como as intensidades relativas dos íons, para coincidir com as de entidades conhecidas. Essa operação é realizada em todos os espectrômetros de massas porque mudanças sutis nos componentes eletrônicos, na limpeza das superfícies e nas condições ambientais do laboratório podem afetar a capacidade do equipamento de reproduzir uma medição significativa. Para as análises menos exigentes em equipamentos de massa nominal, a necessidade de calibração pode ser infrequente, e a verificação de sua resposta mais frequente. No entanto, a alta acurácia de massa exige vigilância constante para alterações mínimas.

Para GCMS, um composto de calibração popular é o FC-43, também conhecido como perfluorotributilamina. Outras misturas de compostos de calibração são utilizadas para ajustar a escala de calibração de um espectrômetro de massas de alta resolução. As misturas de iodeto de césio e sódio (NaCsI) e de polietilenoglicol são populares para LCMS. Em um solvente compatível com LCMS, o NaCsI fluído ou infundido em um estado estacionário em um equipamento fornece uma série de picos monoisotópicos até 4000 Da.

Estão disponíveis kits que contêm uma seleção de peptídeos, proteínas, matrizes e solventes padrão para calibração, ajuste e teste de sensibilidade de espectrômetros de massas de ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI, Matrix-Assisted, Laser-Desorption Ionization). Um, da Sigma Aldrich, é um auxiliar de configuração para analisar misturas complexas de proteínas e peptídeos (700 a 66000 Da).

Massa de bloqueio

Vigilância constante é necessária para as medições mais exigentes com TOFs e equipamentos similares de acurácia muito alta. Uma pequena mudança na temperatura por si só pode mudar os resultados de massa relatados em muitas partes por milhão. Dependendo do tipo de ionização utilizada, a correção da calibração constante pode ser obtida simplesmente utilizando um contaminante conhecido presente na fonte. Ou é possível coletar amostras de um fluxo de íons periodicamente para restabelecer a calibração adequada ao longo de uma análise. A simples adição de um calibrador de massa de bloqueio ao eluente de LC em fluxo, fazendo o "T" após a coluna e antes da entrada do espectrômetro de massas, costuma causar comportamentos não controlados, como supressão de íons, interferência de massa e efeitos do solvente.

Os equipamentos de tempo de voo (TOF, Time-Of-Flight) (descritos anteriormente neste primer) podem atingir uma acurácia baixa de partes por milhão, e os equipamentos de ressonância ciclotrônica de íons por transformada de Fourier (FTICR, Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance) são capazes de ter uma acurácia ainda maior, desde que o número de íons admitidos seja bem controlado. A recalibração em tempo real na massa de bloqueio por meio de correções de qualquer deslocamento de massa remove o erro de massa relativo àquele estabelecido com a calibração da escala de massa. O sinal fraco é outra causa às vezes esquecida, que pode ser corrigida calculando a média da medição de massa sobre o pico de LC, ponderada pela intensidade do sinal.

Uma fonte de electrospray dupla otimizada para adquirir dados de massa exata é ideal para estudos de proteômica ou para a identificação de metabólitos de baixo nível. O método que utiliza duas probes de ESI independentes faz a amostragem do fluxo de correção (ou referência) do spray, utilizando um defletor oscilante acionado por um motor de passo programável. O spray de referência é submetido à amostragem em intervalos predefinidos, garantindo que o ciclo de trabalho de aquisição favoreça o fluxo de líquido que contém o analito. A posição do defletor de amostragem é monitorada em tempo real, permitindo a indexação das duas entradas de líquido, e os dados de referência e de amostra são armazenados em arquivos separados. O projeto elimina interferências entre o analito e os canais de referência.