O primer de Espectrometria de Massas

Uma maior resolução e acurácia de massa medida é agora uma ferramenta dominante para caracterização estrutural em várias aplicações além da descoberta precoce de medicamentos. Com seu amplo alcance de especificidade e utilidade, os equipamentos quadrupolo de tempo de voo (QTOF, Quadrupole Time-Of-Flight), oferecidos por vários fabricantes atualmente, estão substituindo outras tecnologias de LCMS.

Embora existam equipamentos de ordem superior, a alta acurácia de massa de um equipamento QTOF está dentro de algumas partes por milhão do valor verdadeiro, calculado e monoisotópico, e sua alta resolução — até 10 vezes maior do que a de um equipamento quadrupolo — nos permite determinar fórmulas empíricas de acordo com o defeito de massa (onde o valor da massa crítica de hidrogênio e outros átomos presentes servem como um diferenciador). A análise de especiação — por exemplo, discernir a diferença entre um aldeído e um sulfeto — torna-se possível com um aumento na acurácia de massa acima dos limites do quadrupolo para 30 ppm, onde as duas massas diferem em 0,035 Da. No entanto, a diferenciação entre os processos metabólicos que envolvem metilação é mais exigente. A adição de CH₂ produz um aumento sobre o precursor (resposta para o medicamento sozinho) na massa medida de +14,0157 Da, em comparação com uma biotransformação de dois estágios envolvendo hidroxilação (adição de oxigênio) seguida por oxidação em uma ligação dupla (perda de H₂), que produz um aumento de +13,9792 Da. No entanto, ambas as medições, quando limitadas pela resolução nominal — uma resposta de quadrupolo típica — serão semelhantes a +14 Da.

Alta acurácia de massa e baixa resolução

Os equipamentos quadrupolo de baixa resolução têm um bom desempenho para medições de acurácia de massa extremamente alta, como aqueles utilizados para analisar proteínas. As massas de proteínas são geralmente definidas como valores "médios" quando os picos de isótopos não são resolvidos entre si. A massa média é a média ponderada de todas as espécies isotópicas em uma molécula. A resolução de equipamentos normalmente empregada em equipamentos quadrupolo amplia a resposta resolvida para uma proteína de 10 kDa por um fator de x1,27. Esse fator aumenta significativamente à medida que a massa aumenta (por exemplo, para x2,65 a 100 kDa). No entanto, ao reduzir a largura do pico para m/z 0,25 (aumentando a resolução para a resolução de 4000), em vez de limitar a resolução do equipamento a 1000, utilizando a largura de pico típica (m/z 0,6), a situação melhora drasticamente.

Na prática, as análises de ESI-MS de moléculas grandes produzem íons com carga múltipla. Consequentemente, as larguras precisam ser divididas pelo número de cargas em um íon para fornecer a largura na escala de relação massa/carga. Por exemplo, uma proteína de 20 kDa com 10 ou 20 cargas produzirá envelopes de isótopos com unidades de 0,9 ou 0,45 m/z de largura em m/z de cerca de 2000 ou cerca de 1000, respectivamente.

Quando esses íons são observados em um equipamento definido para uma resolução significativamente mais baixa do que a necessária para resolver os isótopos (digamos, resolução inferior a 10000), um único pico é produzido para cada estado de carga. A largura total é determinada combinando a largura do pico do equipamento com a largura teórica do envelope isotópico dividido pelo número de cargas no íon. A largura do pico do equipamento seria determinada no primeiro pico de isótopos de um composto de baixo peso molecular no mesmo valor de m/z que o pico de proteína com múltiplas cargas.

Quanta acurácia precisamos ou podemos alcançar de forma realista, e quais são as concessões?

Considere os requisitos para a caracterização inequívoca das diretrizes do autor do Journal of the American Society for Mass Spectrometry (março de 2004). Para composições C, H, O, N (C_0-100, H_3-74, O_0-4 e N_0-4), uma resposta nominal de massa para carga em 118 precisa apenas de um erro que não exceda 34 ppm para ser inequívoca, onde uma resposta de m/z a 750 exige precisão melhor que 0,018 ppm para eliminar "todas as possibilidades estranhas".

Comparação da precisão de equipamento para equipamento: unidades em milimassa (mmu), erro de medição (ppm) e resolução

De acordo com o Accurate Mass Best Practice Guide do VIMMS Programme, uma iniciativa que faz parte do UK National Measurement System (Sistema Nacional de Medição do Reino Unido), a maioria dos equipamentos utilizados para medições de massa acurada é capaz de atingir uma precisão de 10 ppm ou superior.

Uma massa calculada de 118 Da medida por um espectrômetro de massas moderno com uma acurácia de 2 mmu exibiria um erro de 17 ppm, suficiente para os padrões atuais para a determinação inequívoca de uma fórmula química dessa massa:

Massa exata calculada monoisotópica = 118 Da

Massa acurada medida = 118,002 Da

Diferença = 0,002 mmu

Erro [Diferença/massa exata x 106] = 17 ppm

Um equipamento capaz de uma resposta a 750 m/z, também deficiente em 2 mmu, teria uma acurácia de 2,7 ppm. No primeiro caso, a medição é mais do que suficiente para a identificação inequívoca de uma fórmula química, de acordo com os padrões publicados do Journal of The American Society for Mass Spectrometry. Mas, nesse último caso, a medição é insuficientemente precisa. Apenas a Espectrometria de Massas de ressonância ciclotrônica de íons com transformada de Fourier (FTICR, Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance) de ordem mais alta pode atingir essa precisão em massas mais altas.

Um método abrangente para avaliar a capacidade de medição de acurácia da massa do equipamento, que lembra a utilização pretendida, é pelo cálculo da raiz quadrada média ou do erro de RMS. Para ilustrar sua utilização, o seguinte foi adaptado da especificação de acurácia de medição de massa de um espectrômetro de massas TOF comercial.

"A acurácia da medição de massa do equipamento, sob condições normais de operação, será melhor do que uma certa RMS de ppm ao longo do intervalo de determinada m/z, com base em um número de medições repetidas consecutivas de um pico de analito (de determinada m/z), utilizando um pico de referência adequado (de determinada m/z). Os picos de referência e dos analitos devem ter intensidade suficiente e não devem sofrer interferência de outras massas."

Existem alguns pontos e suposições importantes que precisam ser considerados:

1. Uma calibração do equipamento já foi realizada com picos de massa conhecida utilizando um padrão de calibração. O pico de referência é utilizado para contabilizar qualquer variação na calibração do equipamento ao longo do tempo, e a acurácia da medição de massa é determinada utilizando o pico do analito.
2. Condições de operação normais – também podem incluir detalhes de condições cromatográficas (para especificações de desempenho de LC-MS) e quaisquer condições operacionais de MS relacionadas (por exemplo, resolução de massa, m/z de interesse ou taxa de aquisição espectral).
3. Intensidade suficiente – presume que a contagem de íons não é prejudicial à caracterização da acurácia (medição de massa) e precisão do equipamento em questão. Poucos íons levam a estatísticas de íons ruins, e muitos íons podem levar à saturação do detector, o que resulta em uma maior variação no desvio padrão de medições repetidas e influenciará negativamente o cálculo do erro de RMS (também relevante para a calibração do equipamento).
4. Livre de interferências – presume que a medição de massa do pico de massa conhecida está livre de interferência de íons de massa igual ou semelhante. A sobreposição de picos leva a uma baixa acurácia de medição de massa, o que também é prejudicial à caracterização adequada da acurácia ou precisão do equipamento (também relevante para a calibração do equipamento).
5. A referência é uma boa representação do intervalo de m/z que é relevante para a análise de um tipo de amostra específico.

O erro de RMS é calculado utilizando a seguinte relação, em que E_ppm é o erro em ppm, e n é o número de massas consideradas:

É importante notar que o erro de RMS permite que algumas medições fiquem fora da "janela de interesse" de erro de ppm (por exemplo, RMS de 5 ppm). Para garantir a qualidade das medições, as condições descritas acima precisam ser satisfeitas (principalmente em relação à intensidade e à influência das interferências – estatísticas de íons equilibradas com definição clara de pico nos espectros) durante uma série de injeções repetidas. Muitos números de resolução e acurácia de massa relatados que você vê não são números de erro de RMS, mas se originam de um único íon selecionado (favorável).

É importante lembrar que, em todas as aplicações, um sinal fraco (resolução excessivamente alta) pode resultar em estatísticas de íons insatisfatórias e, portanto, pode ser inutilizável. Um sinal muito forte pode ser igualmente inútil, causando a saturação do detector. O objetivo é obter estatísticas de íons idealmente equilibradas com definição nos espectros.

Algumas comparações com relação à figura:

• a resolução de quadrupolo não é suficiente para diferenciar os dois compostos na figura superior.
• com um poder de resolução de aproximadamente 5000, os dados de TOF mostram claramente dois picos distintos, cuja acurácia de massa pode ser medida em < 5 ppm.

É importante apreciar as várias funções inter-relacionadas desempenhadas na precisão de massa acurada pela mudança entre as definições de massa e o aumento da resolução e fatores como o formato do pico e a necessidade de calibração. Se estes não forem claramente compreendidos e levados em consideração, podem ocorrer atribuições incorretas de massa e outros resultados indesejáveis.

Os dois fragmentos de composições diferentes na figura são do mesmo analito e, portanto, estão na fonte ao mesmo tempo. Mesmo a melhor cromatografia não ajudará nesse caso, então isso enfatiza um dos motivos pelos quais uma resolução mais alta é útil, especialmente na análise de desconhecidos. Isso se aplica igualmente bem aos dados de íons produtos de QTof em relação aos dados de íons produtos de um triplo quadrupolo. Como uma vantagem adicional com esse grau mais alto de resolução, o gráfico de corrente de íons extraídos (XIC, Extracted Ion Current) de cada um permite a diferenciação dos analitos contendo oxigênio e alquila, seletivamente, a partir dos cromatogramas em que os dados de quadrupolo não teriam essa capacidade.

Consulte MS – The Practical Art, LCGC

• Debating Resolution and Mass Accuracy, Vol. 22 No. 2, 118 – 130, fevereiro de 2004
  • Por que essa referência é importante: Trata de muitas das questões no centro dos aspectos práticos de utilização, bem como comparações de fontes da indústria
    
• Petroleomics: MS from the ocean floor, Vol. 26, No. 3 março de 2008
  • Por que essa referência é importante: Discute a utilidade dos equipamentos de resolução mais alta e os compara com expectativas realistas.

Também:

• Methodology for Accurate Mass Measurement of Small Molecules, K. Webb, T. Bristow, M. Sargent, B. Stein, Department of Trade and Industry’s VIMMS Program within the UK National Measurement System, (LGC Limited, Teddington, UK 2004). Documento de orientação do VIMMS 2004
  • Por que essa referência é importante: Uma visão geral breve e concisa dos problemas essenciais para o sucesso de um trabalho de massa acurada medida.
    
• Dealing with the Masses: A Tutorial on Accurate Masses, Mass Uncertainties, and Mass Defects, A. D. Leslie and D. A Volmer, Spectroscopy, Vol. 22, No. 6 de junho de 2007
  • Por que essa referência é importante: Expande o tópico básico para incluir defeito de massa de Kendrick e marcação para peptídeos e proteínas.

Sulfametazina Nominal = 278

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

Massa média – Calculada utilizando todos os isótopos de cada elemento e sua abundância natural.

Massa média de sulfametazina = 278,3313

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

Massa exata calculada – (Monoisotópica). Determinada pela soma das massas dos isótopos individuais para um determinado íon.

Massa exata da sulfametazina = 278,0837

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

Massa acurada – (Na verdade, "massa exata medida"). O que fazemos com nossos equipamentos. É a medida de uma m/z relatada para (normalmente) três ou quatro casas decimais.

À medida que a massa aumenta, as diferenças entre as definições aumentam, e o formato de pico desempenha um papel maior:

Média exata nominal da ubiquitina

[C₃₇₈H₆₃₀N₁₀₅O₁₁₈S] 8556 8560,6254 8565,8730