O primer de Espectrometria de Massas

Os solventes são normalmente escolhidos com base na solubilidade e compatibilidade de um composto de interesse com várias técnicas de ionização utilizadas em LC-MS. A volatilidade e a capacidade do solvente de doar um próton são importantes em ESI e outras técnicas de ionização atmosférica.

Solventes primários próticos, como metanol e misturas com água, como metanol/água na proporção de 1:1 ou acetonitrila/H₂O na proporção de 1:1, são utilizados (embora a mistura de água/metanol aumente a viscosidade muito além da água ou do metanol como solvente puro devido a uma reação exotérmica resultante). A pressão de vapor relativamente baixa da água pode ser prejudicial à sensibilidade quando empregada a 100%. Melhor sensibilidade resulta quando a tensão superficial é diminuída por meio da adição de um solvente orgânico volátil. Os tensoativos com maior afinidade de prótons, embora aumentem a liberação de íons a partir de gotículas nebulizadas, também podem reduzir a sensibilidade.

Cossolventes apróticos, como DMSO a 10% em água e álcool isopropílico, melhoram a solubilidade de alguns compostos. O ácido fórmico é frequentemente adicionado em níveis baixos (0,1%) para facilitar a ionização, garantindo que o analito seja mais básico do que o solvente. No entanto, mesmo em pequenas quantidades, alguns ácidos, como o TFA, embora sejam necessários para compostos de outra forma insolúveis, podem limitar a sensibilidade.

No modo de ionização de ESI, tampões e sais (Na⁺, K⁺ e fosfato) causam uma redução na pressão de vapor e, consequentemente, um sinal reduzido. O aumento da tensão superficial das gotículas e a redução da volatilidade resultante podem ser remediadas utilizando tampões relativamente mais voláteis, como o acetato de amônio, formado por um par ácido-base fraco.

Considerações sobre solventes

• O solvente na fase gasosa limita a ionização por ESI a moléculas mais básicas que o solvente. A exceção é a fotoionização (que não é uma ionização de ácido/base), mas, mesmo assim, mediada por solvente.
• A remoção de solvente e de vapor de água da região de ionização aumenta os tipos de compostos que podem ser ionizados à pressão atmosférica.
• A redução do volume do líquido em relação à amostra ou ao analito de interesse contido no líquido melhora o desempenho de ESI (ou seja, taxas de fluxo mais baixas).
• Solventes úteis
  • Água
  • Acetonitrila
  • Metanol
  • Etanol
  • Propanol
  • Isopropanol
• Aditivos aceitáveis
  • Ácido acético
  • Ácido fórmico
  • Hidróxido de amônio
  • Formiato de amônio (concentração de sal = 10 mM ou menos)
  • Acetato de amônio (concentração de sal = 10 mM ou menos)
• Sais não voláteis (fosfato, borato, citrato, etc.)
  • Pode depositar nos capilares da fonte e do plugue, exigindo, assim, mais operações de limpeza e manutenção
  • Projetos de fonte modernos podem lidar melhor com não voláteis do que projetos mais antigos
• Agentes de superfície ativa (tensoativos/detergentes) suprimem a ionização por electrospray
• Ácidos inorgânicos são corrosivos
• Ácido trifluoroacético (TFA)
  • Até certo ponto, suprime o electrospray de íons positivos em níveis que excedem 0,01%.
  • Electrospray de íon negativo bastante suprimido.
• Trietilamina (TEA)
  • Alto PA (232 Kcal/mol) produz um íon [M+H] + intenso em m/z 102
  • Suprime o electrospray de íons positivos de compostos menos básicos.
• Tetrahidrofurano (THF)
  • 100% THF é altamente inflamável, então a APCI e a maioria das técnicas de interface utilizam nitrogênio como gás nebulizador. (Utilizar ar cria um risco de explosão).
  • Reage com tubulação de PEEK.

Supressão de íons e escolha de recheios

A supressão de íons é um dos problemas mais visíveis enfrentados pelos espectrometristas que utilizam ESI como técnica de ionização. A publicação da U.S. Food and Drug Administration (FDA), Guidance for Industry on Bioanalytical Method Validation (Registro Federal, 66, 100, 28526) em 2001 indica a necessidade de tal consideração para garantir que a qualidade da análise não seja comprometida. O artigo observa vários protocolos experimentais para avaliar a presença de supressão de íons. Compara-se a resposta de monitoramento de reações múltiplas (MRM, Multiple-Reaction-Monitoring) (áreas de pico ou alturas de pico) de um analito em uma amostra pós-extração fortificada com a do analito injetado diretamente na fase móvel pura. Um sinal de analito baixo na matriz em comparação com o solvente puro indica a presença de entidades interferentes.

Uma publicação de C. Mallet et al. descreve onde os efeitos da matriz do cromatograma no analito (e no padrão interno) estão presentes. Os experimentadores utilizam um fluxo contínuo de uma solução de padrões contendo o analito de interesse e seu padrão interno adicionado ao efluente da coluna. Após a injeção de um extrato de amostra em branco no sistema LC, uma queda na linha de base constante indica a supressão da ionização do analito devido à presença de material interferente.

Recheios de coluna

Uma mudança facilitadora na tecnologia é o advento de recheios híbridos de coluna e partículas altamente seletivas com menos de dois micrômetros de diâmetro. Os recheios híbridos dependem menos de modificadores de fase móvel que podem causar supressão de íons e o aumento da seletividade das partículas.

LC de pressão ultra-alta versus HPLC tradicional

A recente comercialização do trabalho do Professor J. Jorgenson (Universidade da Carolina do Norte), geralmente referido como UHPLC (Ultra High Pressure Liquid Chromatography, cromatografia líquida de pressão ultra-alta), apresenta um potencial para aumentar as informações derivadas de análises típicas de LCMS. Comercializada pela Waters Corporation como UPLC, ou cromatografia líquida de altíssimo desempenho, a capacidade de pico aumentada em relação à HPLC torna possível definir entidades químicas que, de outra forma, teriam coeluído sob os picos mais amplos de HPLC. Concentrar picos em faixas de (normalmente) larguras de dois segundos ou menos aumenta o potencial para aumento da sensibilidade favorecendo a resposta do espectrômetro de massas às melhorias na relação sinal-ruído.

O conceito de UPLC altera parâmetros conhecidos estabelecidos na prática de separações tradicionais, como taxas de fluxo, tamanhos de partículas — até mesmo nossa apreciação das curvas de van Deemter. À medida que a pressão operacional aumenta a partir de aproximadamente 2000 psi para até 20000 psi, os diâmetros das partículas menores que 2 µm se aproximam do limite teórico descrito em 1969 por John Knox em sua "equação de Knox". Uma vez que os problemas resultantes de aumento de estresse mecânico e efeitos térmicos exagerados foram resolvidos, as melhorias no desempenho do MS vêm como uma consequência teórica um tanto contraintuitiva.

Consulte também:

• C.R. Mallet, Z. Lu, and J.R. Mazzeo, A study of ion suppression effects in electrospray ionization from mobile phase additives and solid-phase extracts, Rapid Commun. Mass Spectrom. Vol 18, 1, 49–58 2004.
  • Por que essa referência é importante: Trabalho frequentemente consultado que aborda comparações de SPE.
    
• L.L. Jessome, D. A. Volmer, Ion Suppression: A Major Concern in Mass Spectrometry, LCGC, Vol 24, 5 de maio de 2006
  • Por que essa referência é importante: Fornece uma discussão abrangente sobre um dos principais obstáculos encontrados na ESI: as alterações de afinidade de prótons de fase gasosa que afetam a quantificação.
    
• Toyo'oka, Toshimasa, Determination Methods for Biologically Active Compounds by Ultra-Performance Liquid Chromatography Coupled with Mass Spectrometry: Application to the Analyses of Pharmaceuticals, Foods, Plants, Environments, Metabonomics, and Metabolomics, Journal of Chromatographic Science, Vol 46, 3, março de 2008, pp. 233-247
  • Por que essa referência é importante: Fornece uma visão geral abrangente das publicações relacionadas à prática moderna de cromatografia.
    
• U. Neue, Theory of peak capacity in gradient elution, J Chromatogr A. 2005 Jun 24;1079 (1-2):153-61.
  • Por que essa referência é importante: Discussão contemporânea da prática moderna de cromatografia.
    
• J. H. Knox and M. Saleem, Kinetic Conditions for Optimum Speed and Resolution in Column Chromatography, J. Chromatogr. Sci., 7 (1969) 614-622
  • Por que essa referência é importante: Um dos artigos fundamentais de previsão da prática cromatográfica moderna.