Guia para iniciantes em cromatografia líquida

A cromatografia líquida (LC, Liquid Chromatography) foi definida no início dos anos 1900 pelo trabalho do botânico russo Mikhail S. Tswett. Seus estudos pioneiros se concentraram na separação de compostos (pigmentos de folhas), extraídos de plantas utilizando um solvente, em uma coluna preenchida com partículas.

Tswett encheu uma coluna de vidro aberta com partículas. Dois materiais específicos que ele achou úteis eram giz em pó (carbonato de cálcio) e alumina. Ele despejou sua amostra (extrato de solvente de folhas de planta homogeneizadas) na coluna e permitiu que ela passasse para o leito de partículas. Isso foi seguido por solvente puro. À medida que a amostra descia através da coluna por gravidade, faixas de cores diferentes podiam ser vistas se separando porque alguns componentes estavam se movendo mais rápido do que outros. Ele relacionou essas faixas de cores separadas diferentes aos diferentes compostos que estavam originalmente contidos na amostra. Ele havia criado uma separação analítica desses compostos com base na força distinta de atração química de cada composto pelas partículas. Os compostos que eram mais fortemente atraídos pelas partículas diminuíram a velocidade, enquanto outros compostos mais fortemente atraídos pelo solvente se moviam mais rapidamente. Esse processo pode ser descrito da seguinte forma: os compostos contidos na amostra se distribuem, ou particionam de forma diferente entre o solvente em movimento, chamado de fase móvel, e as partículas, chamadas de fase estacionária. Isso faz com que cada composto se mova a uma velocidade diferente, criando, assim, uma separação dos compostos.

Tswett cunhou o nome cromatografia (das palavras gregas croma, que significa cor, e grafia, que significa escrita – literalmente, escrita em cores) para descrever seu experimento colorido. (Curiosamente, o nome russo Tswett significa cor.) Hoje, a cromatografia líquida, em suas várias formas, tornou-se uma das ferramentas mais poderosas da química analítica. 

Técnica 2.Na Figura C, as amostras são colocadas em papel (fase estacionária). O solvente (fase móvel) é então adicionado ao centro do ponto para criar um fluxo radial para fora. Esta é uma forma de cromatografia em papel. (A cromatografia em papel clássica é realizada de maneira semelhante à da TLC com fluxo linear.) Na imagem superior, a mesma amostra de corante preto FD&C é aplicada ao papel.

Observe a diferença no poder de separação para este papel em particular quando comparado com a placa de TLC. O anel verde indica que o papel não pode separar os corantes amarelos e azuis um do outro, mas poderia separar esses corantes dos vermelhos. Na imagem inferior, uma amostra verde, composta dos mesmos corantes amarelos e azuis, é aplicada ao papel. Como seria de esperar, o papel não consegue separar os dois corantes. No meio, uma amostra roxa, composta por corantes vermelhos e azuis, foi aplicada ao papel. Eles estão bem separados.

Técnica 3.Nessa técnica, a mais poderosa abordagem, a amostra passa através de uma coluna ou um dispositivo de cartucho contendo partículas apropriadas (fase estacionária). Essas partículas são chamadas de material de retenção cromatográfico. O solvente (fase móvel) flui através do dispositivo. Na extração em fase sólida (SPE, Solid-Phase Extraction), a amostra é carregada no cartucho e o fluxo de solvente carrega a amostra através do dispositivo. Como no experimento de Tswett, os compostos na amostra são separados se deslocando em diferentes velocidades individuais através do dispositivo. Aqui, a amostra preta é carregada em um cartucho. Solventes diferentes são utilizados em cada etapa para criar a separação.

Quando o formato de cartucho é utilizado, há várias maneiras de obter fluxo. A gravidade ou o vácuo podem ser utilizados para colunas que não foram projetadas para resistir à pressão. Normalmente, as partículas nesse caso são maiores em diâmetro (> 50 mícrons) para que haja menos resistência ao fluxo. Colunas de vidro abertas (experiência de Tswett) são um exemplo disso. Além disso, pequenas colunas de plástico, normalmente na forma de barris de seringa, podem ser preenchidas com partículas de material de retenção e utilizadas para realizar o preparo de amostras. Isso é chamado de extração em fase sólida (SPE, Solid-Phase Extraction). Aqui, o dispositivo cromatográfico, chamado de cartucho, é utilizado, geralmente com fluxo assistido por vácuo, para limpar uma amostra muito complexa antes que ela seja analisada posteriormente.

São necessários tamanhos de partícula menores (< 10 mícrons) para melhorar o poder de separação. No entanto, partículas menores têm maior resistência ao fluxo, então, pressões mais altas são necessárias para criar a taxa de fluxo de solvente desejada. Bombas e colunas projetadas para suportar alta pressão são necessárias. Quando uma pressão moderada a alta é utilizada para fazer o solvente fluir através da coluna cromatográfica, a técnica é chamada de HPLC.

O que é Cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC, High Performance Liquid Chromatography)?

A sigla HPLC, cunhada pelo falecido Prof. Csaba Horváth para seu artigo Pittcon de 1970, indicava originalmente o fato de que a alta pressão era utilizada para gerar o fluxo necessário para a cromatografia líquida em colunas preenchidas. No início, as bombas tinham apenas uma capacidade de pressão de 500 psi (35 bar). Isso foi chamado de cromatografia líquida de alta pressão ou HPLC. O início da década de 1970 viu um grande salto em tecnologia. Esses novos equipamentos de HPLC podiam desenvolver até 6000 psi (400 bar) de pressão e incorporavam injetores, detectores e colunas aprimorados. A HPLC realmente começou a se estabelecer em meados da década de 1970. Com os avanços contínuos no desempenho durante esse tempo (partículas menores, pressão ainda maior), a sigla HPLC permaneceu a mesma, mas o nome foi alterado para cromatografia líquida de alto desempenho.

A cromatografia líquida de alto desempenho é agora uma das ferramentas mais poderosas da química analítica. Ela tem a capacidade de separar, identificar e quantificar os compostos que estão presentes em qualquer amostra que possa ser dissolvida em um líquido. Hoje, compostos em concentrações de traços tão baixas quanto partes por trilhão (ppt) podem ser facilmente identificados. A HPLC pode ser, e tem sido, aplicada a praticamente qualquer amostra, como produtos farmacêuticos, alimentos, nutracêuticos, cosméticos, matrizes ambientais, amostras forenses e substâncias químicas industriais.

O que é cromatografia líquida de altíssimo desempenho (tecnologia UPLC, UltraPerformance Liquid Chromatography)?

Em 2004, outros avanços na tecnologia de equipamentos e colunas foram feitos para atingir aumentos muito significativos na resolução, velocidade e sensibilidade em cromatografia líquida. Colunas com partículas menores (1,7 mícron) e equipamentos com recursos especializados projetados para fornecer fase móvel a 15000 psi (1000 bar) foram necessárias para atingir um novo nível de desempenho. Um novo sistema teve que ser criado de forma holística para realizar a cromatografia líquida de altíssimo desempenho, agora conhecida como tecnologia UPLC.

A pesquisa básica está sendo conduzida hoje por cientistas que trabalham com colunas contendo partículas ainda menores de 1 mícron de diâmetro e equipamentos capazes de funcionar a 100000 psi (6800 bar). Isso nos dá uma ideia do que podemos esperar no futuro.