O primer de Espectrometria de Massas

Na Espectrometria de Massas, a capacidade de exercer controle sobre os experimentos é extremamente importante. Quando um íon é criado sob condições cuidadosamente controladas, ele deve ser detectado como um evento distinto com a sensibilidade apropriada. A carga mínima de vapor fez da GC uma opção inicial ideal como tecnologia hifenizada, mas apenas para cerca de 20% dos compostos. Atualmente, aerossolizamos eluente de LC com mais frequência como meio de introduzir analitos para ionização em um espectrômetro de massas, uma técnica que requer um ambiente de vácuo para garantir o controle.

Um elemento importante do projeto de qualquer espectrômetro de massas é a capacidade de bombeamento. O vácuo deve ser bem distribuído nas regiões atmosféricas rarefeitas de um equipamento e deve ser suficiente para compensar as necessidades de projeto, como o tamanho da entrada de íons e a quantidade de vapor que precisa ser removida.

Os requisitos de bombeamento de LC-MS dependem da interface utilizada. Em última análise, esse foi um dos motivos que impulsionou o desenvolvimento da fonte de API, em que o vapor é removido antes da entrada no MS.

O analisador é o meio que um equipamento tem de separar ou diferenciar íons introduzidos. Tanto íons positivos quanto negativos (bem como espécies neutras não carregadas) se formam na fonte de íons. No entanto, apenas uma polaridade é registrada em um determinado momento. Os equipamentos modernos podem alternar polaridades em milissegundos, produzindo registros de alta fidelidade até mesmo de eventos transientes e rápidos, como aqueles típicos de separações por GC ou por cromatografia líquida de altíssimo desempenho (UPLC, Ultra Performance Liquid Chromatography) em que os picos têm apenas cerca de um segundo de largura.

Quadrupolos

Em 1953, os físicos da Alemanha Ocidental Wolfgang Paul e Helmut Steinwedel descreveram o desenvolvimento de um espectrômetro de massas quadrupolo. Os potenciais de radiofrequência (RF) e de corrente contínua constante (CC) sobrepostos entre quatro hastes paralelas demonstraram atuar como um separador de massa, ou filtro, em que apenas íons dentro de uma faixa de massa específica, exibindo oscilações de amplitude constante, poderiam ser coletados no analisador .

Os fabricantes dos equipamentos atuais os destinam a aplicações específicas. Os espectrômetros de massas quadrupolo simples exigem uma matriz limpa para evitar a interferência de íons indesejados e exibem uma sensibilidade muito boa.

Espectrômetros de massas triplo quadrupolo ou tandem quadrupolo (MS/MS) adicionam a um equipamento quadrupolo simples um quadrupolo adicional, que pode atuar de várias maneiras. Uma maneira é simplesmente separar e detectar os íons de interesse em uma mistura complexa pela relação massa-carga (m/z) exclusiva dos íons. Outra forma de um quadrupolo adicional ser útil é quando utilizado em conjunto com experimentos de fragmentação controlada. Esses experimentos envolvem a colisão de íons de interesse com outra molécula (normalmente um gás, como o argônio). Em tal aplicação, um íon precursor fragmenta-se em íons produtos, e o equipamento de MS/MS identifica o composto de interesse por suas partes constituintes exclusivas.

O analisador quadrupolo consiste em quatro hastes, que geralmente são organizadas em paralelo e feitas de metal, como ligas de molibdênio. Uma grande quantidade de arte e ciência foi investida no desenvolvimento do projeto de quadrupolo. As massas são classificadas pelo movimento de seus íons, que os campos de corrente contínua (CC) e de radiofrequência (RF) induzem para o analisador de um equipamento. A alteração sistemática da intensidade do campo por meio do software operacional efetivamente altera qual valor de m/z é filtrado ou transmitido através do detector a qualquer momento. Os quadrupolos produzem uma resolução mais baixa do que alguns projetos de espectrômetro de massas, como equipamentos de tempo de voo (TOF, Time-Of-Flight). No entanto, os quadrupolos são equipamentos relativamente simples, fáceis de utilizar e altamente utilitários que oferecem uma variedade de interfaces a um custo relativamente baixo.

Alguns termos, definidos de forma mais completa posteriormente neste primer, são necessários para comparar e descrever as capacidades de MS:

Poder de resolução

Frequentemente abreviado como "res.", o poder de resolução é a capacidade de um espectrômetro de massas de separar duas massas:

• Res. baixa = massa unitária = 1000
• Res. superior ou moderada = 1000 a 10000
• Res. alta = Mais de 10000
• Res. muito alta = de 3 a 5 milhões
• Um exame mais detalhado da resolução e de como a medimos aparece na seção "Resolução e acurácia de massa".

Massa exata é o valor teórico exato para a massa de um composto, enquanto massa acurada é o valor da massa medida para um composto com uma barra de erro associada, como 5 ppm. A massa acurada também é frequentemente utilizada para se referir à técnica em vez da massa medida. Critérios normalmente aceitos para trabalho de massa exata (por exemplo, para publicar em uma revista ou registrar uma patente) é a capacidade de derivar uma medição em um equipamento dentro de 5 ppm de sua massa teórica: 5 ppm a 250 Da é 1,25 mDa (não confundir com 5 mDa, que seria 20 ppm a 250 Da)

MS/MS

Descreve uma variedade de experimentos de monitoramento de reações múltiplas (MRM, Multiple-Reaction Monitoring) e monitoramento de reação única (SRM, Single-Reaction Monitoring). Ou seja, monitorar a transição de íons precursores, ou fragmentações, para íons produtos, que, em geral, tendem a melhorar a seletividade, especificidade e/ou sensibilidade de detecção em relação a um experimento de equipamento de estágio único. São utilizados dois analisadores de massa em série, ou dois estágios de análise de massas, em um único equipamento.

Em um espectrômetro de massas triplo quadrupolo, existem três conjuntos de filtros quadrupolo, embora apenas o primeiro e o terceiro funcionem como analisadores de massa. Projetos mais recentes têm diferenciado suficientemente o dispositivo do meio (substituindo o quadrupolo de projetos anteriores), adicionando mais funções de modo que o termo "triplo quadrupolo" ou "tandem quadrupolo" seja, em vez disso, frequentemente utilizado. O primeiro quadrupolo (Q1), atuando como um filtro de massa, transmite e acelera um íon selecionado em direção ao Q2, que é chamado de cela de colisão. Embora, em alguns modelos, o Q2 seja semelhante aos outros dois quadrupolos, a RF é imposta a ele apenas para transmissão, não para seleção de massa. A pressão no Q2 é maior, e os íons colidem com o gás neutro na cela de colisão. O resultado é a fragmentação por dissociação induzida por colisão (CID, Collision-Induced Dissociation). Os fragmentos são então acelerados no Q3, outro filtro de massa de varredura, que os classifica antes de entrarem em um detector.

A dissociação induzida por colisão (CID, Collision-Induced Dissociation), também conhecida como dissociação ativada por colisão (CAD, Collisionally Activated Dissociation), é um mecanismo pelo qual os íons moleculares são fragmentados na fase gasosa, geralmente por aceleração por potencial elétrico para uma alta energia cinética na região de vácuo, seguida por colisão com moléculas de gás neutro, como hélio, nitrogênio ou argônio. Uma parte da energia cinética é convertida ou internalizada pela colisão, o que resulta na quebra de ligações químicas, e o íon molecular é reduzido a fragmentos menores. Alguns métodos de fragmentação de "finalidade especial" semelhantes incluem dissociação de transferência de elétrons (ETD, Electron Transfer Dissociation) e dissociação de captura de elétrons (ECD, Electron Capture Dissociation). Consulte a seção sobre "Métodos de ionização biomolecular".

O íon precursor de 237 Da entrando à esquerda foi fragmentado na cela de colisão de MS/MS. O sistema de dados pode exibir apenas fragmentos de interesse (nem todos os fragmentos produzidos), produzindo um espectro relativamente simples em relação ao espectro de MS de varredura completa. É possível controlar a extensão da fragmentação assim como a escolha do íon precursor.

HPLC de fase reversa

O termo "fase reversa" descreve o modo de cromatografia que é exatamente o oposto da fase normal, ou seja, a utilização de uma fase móvel polar e uma fase estacionária não polar (hidrofóbica). A Figura S-2 ilustra a mistura de três corantes pretos sendo separada utilizando esse protocolo.

Em alguns setores regulamentados, para atender à especificação de identificação de composto positivo, as transições de MRM são de 1,5 "ponto de identificação", enquanto os traços de SIR são de 1,0. Portanto, presumindo seletividade suficiente, para atingir 3 "IPS", são necessárias 2 transições de MRM, mas três traços de SIR.

Um analisador de massas de setor magnético ou um analisador de massas de campo de setor, é um projeto de equipamento antigo que persiste hoje, embora minimamente (tendo sido substituído por equipamentos de ESI modernos que podem operar no modo de ionização de ESI). Por exemplo, o Waters AutoSpec é utilizado universalmente para análise de dioxina de sensibilidade extremamente alta.

Os setores dobram as trajetórias de íons em forma de arco. As relações "momento-carga" dos íons determinam o raio das trajetórias, que são determinadas por um campo elétrico e/ou magnético. Íons com relações de m/z maiores seguem através de caminhos mais longos do que aqueles com relações menores. Os caminhos são controlados por meio da variação da intensidade do campo magnético. Os espectrômetros de massas de focagem dupla associam campos magnéticos e elétricos em várias combinações, embora o setor elétrico seguido pelo magnético seja mais comum. Esta primeira das hibridizações utiliza o setor elétrico para focar os íons por sua energia cinética conforme eles saem da fonte. A focagem angular precedida por uma focagem energética produz separações de íons com a mesma massa nominal, mas com fórmulas químicas diferentes.

Um equipamento de captura de íons opera em princípios semelhantes aos de um equipamento quadrupolo. No entanto, ao contrário do equipamento quadrupolo, que filtra íons de fluxo, tanto o equipamento de captura de íons quanto equipamento de cíclotron de íons (ICR, Ion Cyclotron) mais capacitado armazenam íons em um espaço tridimensional. Antes que a saturação ocorra, a captura ou o cíclotron permitem que os íons selecionados sejam ejetados, de acordo com suas massas, para detecção. Uma série de experimentos pode ser realizada dentro dos limites da captura, fragmentando um íon de interesse para definir melhor o precursor por seus fragmentos. Os campos gerados por tensões de RF aplicadas a uma geometria empilhada ou em "sanduíche" (eletrodos de terminação em extremidades opostas) prendem íons no espaço entre os dois eletrodos. Aumentar ou fazer a varredura da tensão de RF ejeta íons de sua frequência secular ou condição de captura. O intervalo dinâmico às vezes é limitado. O volume e a capacidade finitos para íons limitam o intervalo do equipamento, especialmente para amostras em matrizes complexas.

Os equipamentos de captura de íons foram introduzidos na década de 1980. Porém, as limitações impostas pelo esquema de ionização interna utilizado nesses equipamentos anteriores impediram sua utilização para muitas aplicações. Somente com o advento da ionização externa os equipamentos se tornaram mais universalmente práticos.

A capacidade de realizar fragmentação sequencial e, assim, derivar mais informações estruturais de um único analito (ou seja, fragmentar um íon, selecionar um fragmento específico e repetir o processo) é chamada de MSn. Os picos cromatográficos de GC não são largos o suficiente para permitir mais de uma única fragmentação (MS/MS ou MS2). Os equipamentos de captura de íons realizam experimentos de MS/MS ou de fragmentação no tempo, e não no espaço, como os equipamentos quadrupolo e de setor. Portanto, eles não podem ser utilizados em certos experimentos de MS/MS, como comparações de íons precursores e perda neutra. Além disso, na operação de MS/MS com um equipamento de captura de íons, o terço inferior do espectro de MS/MS é perdido, uma consequência do projeto da captura. Para compensar a perda, alguns fabricantes disponibilizam, por meio de seus softwares, requisitos de varredura mais amplos que exigem a troca de parâmetros operacionais durante a aquisição de dados.

O projeto da captura coloca um limite superior na relação entre a massa/carga de um precursor (m/z) e o menor íon de fragmentos capturado, normalmente conhecido como a "regra do terço". Por exemplo, íons de fragmentos de um íon em m/z 1500 não serão detectados abaixo de m/z 500 — que é uma limitação significativa para o sequenciamento de novo de peptídeos. A captura de íons tem um intervalo dinâmico limitado, o resultado de efeitos de carga-espaço quando muitos íons entram no espaço de captura. Os fabricantes desenvolveram uma varredura automatizada, que conta os íons antes que eles entrem na captura, limitando ou bloqueando o número de entrada permitido. Ainda é possível encontrar dificuldades quando uma quantidade relativamente pequena de um íon de interesse está presente em uma grande população de íons de fundo.

Devido às semelhanças no projeto funcional, os equipamentos quadrupolo são hibridizados para incorporar as vantagens do comportamento de captura de íons e quadrupolo de fluxo para melhorar a sensibilidade e permitir experimentos em tempo real que não são possíveis com nenhum dos dois isoladamente. Esses equipamentos às vezes são chamados de capturas lineares ou Q-traps). O aumento do volume de um equipamento de captura linear (em relação a uma captura de íons tridimensional) melhora o intervalo dinâmico.

Os equipamentos de captura de íons não fazem a varredura como um equipamento quadrupolo o faz; então, utilizar a técnica de monitoramento de íon único (SIM, Single Ion Monitoring) ou de registro de íon único (SIR, Single Ion Recording) não melhora a sensibilidade em capturas de íons como faz em equipamentos quadrupolo e de setor.

A ressonância ciclotrônica de íons com transformada de Fourier (FTICR, Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance) representa a capacidade extrema de medição de massa com a competência de separar massas estreitamente relacionadas. Embora impraticável para a maioria das aplicações, um ímã de 14,5 teslas pode atingir uma resolução de mais de 3,5 milhões e, assim, exibir a diferença entre entidades moleculares cujas massas variam em menos do que a massa de um único elétron.

Os equipamentos de cíclotron capturam os íons eletrostaticamente em uma célula utilizando um campo magnético constante. Os pulsos de tensão de RF criam um movimento iônico orbital, e os íons em órbita geram um pequeno sinal nas placas de detecção da célula (a frequência orbital do íon). A frequência está inversamente relacionada à m/z dos íons, e a intensidade do sinal é proporcional ao número de íons da mesma m/z na célula.Em pressões de célula muito baixas, um equipamento de cíclotron pode manter a órbita de um íon por períodos prolongados, fornecendo medições de resolução muito alta.

A irradiação fora de ressonância prolongada para dissociação induzida por colisão (SORI-CID, Sustained Off-Resonance Irradiation, Collision-Induced Dissociation) é uma técnica de CID utilizada em Espectrometria de Massas de ressonância ciclotrônica de íons com transformada de Fourier. Os íons são acelerados no movimento do cíclotron, em que o aumento da pressão resulta em colisões que produzem fragmentos. Após a fragmentação, a pressão é reduzida, e o alto vácuo restaurado para analisar os íons de fragmentos.

Os equipamentos de tempo de voo (TOF, Time-Of-Flight), embora desenvolvidos há muitos anos, tornaram-se a base para muitos trabalhos modernos devido à sua eletrônica rápida e precisa e às técnicas de ionização modernas, como ESI. Um equipamento de TOF fornece medição de massa acurada para dentro de algumas partes por milhão (ppm) da verdadeira massa de uma molécula. Como analisador de massas temporariamente dispersivo, o equipamento de TOF é utilizado de forma linear ou, com o auxílio de grades eletrostáticas e lentes, como um reflectron. Quando operado como um reflectron, a resolução é aumentada sem perder drasticamente a sensibilidade ou a necessidade de aumentar o tamanho do tubo de voo (ou deslocamento).

As análises de TOF envolvem acelerar um grupo de íons, em uma breve explosão, para um detector. Os íons saem da fonte, cada um tendo recebido de um eletrodo "propulsor" uma carga elétrica idêntica, ou potencial. O potencial de cada íon acelera, ou dispara, em um tubo de pressão muito baixa. Como todos os íons carregados de forma semelhante compartilham a mesma energia cinética (energia cinética = ½ mv² em que m é a massa do íon, e v, a velocidade), aqueles com massas menores evidenciam maior velocidade e um intervalo menor antes de atingir o detector. Como a massa, a carga e a energia cinética determinam o tempo de chegada de um íon no detector, a velocidade do íon pode ser representada como v = d/t = (2KE/m)^1/2. Os íons se deslocam a uma determinada distância (d), no tempo (t), em que t depende da relação massa/carga (m/z). Como todas as massas são medidas para cada "impulso", o equipamento de TOF pode atingir uma sensibilidade muito alta em relação aos equipamentos de varredura.

Atualmente, os sistemas de MS quadrupolo fazem varreduras normalmente a 10000 Da, ou amu, por segundo. Portanto, uma varredura abrangente, mesmo que de curta duração — um pico de LC ou GC de 1 segundo, por exemplo — capturaria cada íon 10 vezes, ou mais, em cada segundo. O detector do equipamento de TOF registra íons bombardeando a placa com uma diferença de nanossegundos um do outro. Essa resolução oferece os recursos adicionais de uma ampla faixa dinâmica e maior sensibilidade quando comparada diretamente a um equipamento de varredura, como um quadrupolo. No entanto, o equipamento quadrupolo é, em geral, mais sensível ao detectar analitos-alvo em misturas complexas e, por isso, é, normalmente, uma ferramenta de quantificação melhor. Alguns equipamentos, como as capturas de íons, oferecem uma combinação desses recursos. Porém, até o advento dos equipamentos híbridos, nenhum deles era capaz de fornecer desempenho de alta qualidade em todos os aspectos.

Projetos iniciais de MALDI-TOF (utilizando ionização e dessorção a laser assistida por matriz) aceleravam os íons para fora da fonte de ionização imediatamente. Sua resolução era relativamente fraca, e sua acurácia, limitada. A extração atrasada (DE, Delayed Extraction), desenvolvida para equipamentos de MALDI-TOF, "resfria" e concentra os íons por aproximadamente 150 nanossegundos após sua formação. Em seguida, ela acelera os íons no tubo de voo. Os íons resfriados têm uma distribuição de energia cinética mais baixa do que os não resfriados e, em última análise, reduzem a difusão temporal dos íons à medida que entram no analisador de TOF, resultando em maior resolução e acurácia. A DE é significativamente menos vantajosa com macromoléculas (por exemplo, proteínas > 30000 Da).

Híbridos

O termo "híbrido" se aplica a vários projetos de espectrômetros de massas que são compostos de tecnologias existentes, como focagem dupla, setores magnéticos e, mais recentemente, capturas de íons que "fronteiam" os cíclotrons. Um dos projetos mais interessantes, o espectrômetro de massas quadrupolo de tempo de voo (QTOF, Quadrupole Time-Of-Flight), acopla um equipamento de TOF a um equipamento quadrupolo. Esse acoplamento resulta na melhor combinação de várias características de desempenho: medição de massa acurada, a capacidade de realizar experimentos de fragmentação e quantificação de alta qualidade.

Uma evolução posterior produziu a associação de medições e separações de mobilidade iônica com Espectrometria de Massas tandem. A Espectrometria de Massas de mobilidade iônica (observação: eu utilizo "IMMS" como uma sigla aqui, pois a Espectrometria de Massas de imageamento é frequentemente abreviada por "IMS") é uma técnica que diferencia íons com base em uma combinação de fatores: seu tamanho, seu formato e sua carga, bem como sua massa. Os dispositivos de IMMS são normalmente utilizados em aeroportos e unidades de campo portáteis para detectar rapidamente (20 ms) moléculas pequenas cuja mobilidade é conhecida: por exemplo, determinados narcóticos e explosivos. Quando adaptada aos equipamentos de ordem superior, a IMMS fornece uma dimensão ortogonal de separação (para LC e MS) e alguns recursos habilitadores exclusivos, incluindo:

• Separação de isômeros, isóbaros e conformadores (de proteínas a moléculas pequenas) e determinação de sua seção transversal de colisão rotacional média
• Separação aprimorada de misturas complexas (por MS ou LC-MS) levando ao aumento da capacidade de pico e cleanup da amostra (separação física de íons, especialmente ruído químico, e íons que interferem nos analitos de interesse)
• Desempenho de CID/IMMS, IMMS/CID ou CID/IMMS/CID e aprimoramento da quantidade de informações significativas que podem ser obtidas a partir de experimentos de fragmentação em estudos de elucidação estrutural.

Em todos os três cenários analíticos, a combinação de Espectrometria de Massas tandem e de mobilidade iônica de alta eficiência pode ajudar a superar desafios analíticos que não poderiam ser resolvidos por outros meios analíticos, incluindo equipamentos convencionais de cromatografia líquida ou de Espectrometria de Massas.

O artigo de revisão de H.H. Hill Jr., et al, citado no final desta seção, compara e contrasta vários tipos de espectrômetros de massas de mobilidade iônica disponíveis a partir da publicação do artigo de 2007 — e descreve as vantagens de aplicá-los a uma ampla variedade de analitos. Ele aborda quatro métodos de separação por mobilidade iônica utilizados atualmente com Espectrometria de Massas:

• Espectrometria de mobilidade iônica em tempo de deslocamento (DTIMS, Drift-Time Ion Mobility Spectrometry)
• Espectrometria de mobilidade iônica de aspiração (AIMS, Aspiration Ion Mobility Spectrometry)
• Espectrometria de mobilidade diferencial (DMS, Differential-Mobility Spectrometry), também chamada de espectrometria de mobilidade iônica de forma de onda assimétrica de campo (FAIMS, Field-Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry)
• Espectrometria de mobilidade iônica de traveling wave (TWIMS, Traveling-Wave Ion Mobility Spectrometry)

De acordo com os autores, "a DTIMS fornece o maior poder de resolução de IMS e é o único método (IMMS) que pode medir diretamente seções transversais de colisão. A AIMS é um método de separação por mobilidade de baixa resolução, mas pode monitorar íons continuamente. A DMS e a FAIMS oferecem capacidade de monitoramento contínuo de íons, bem como separações por mobilidade iônica ortogonal, nas quais é possível atingir uma alta seletividade de separação. A TWIMS é um método novo (IMMS) cujo poder de resolução é relativamente baixo. No entanto, ela demonstra boa sensibilidade e está bem integrada à operação de um espectrômetro de massas comercial."

Juntamente com a MS, a mobilidade iônica também está sendo aplicada para investigar as estruturas em fase gasosa de biomoléculas. Pringle et al.(citados aqui) examinam a separação por mobilidade de alguns íons de peptídeos e proteínas utilizando um equipamento de tempo de voo de aceleração ortogonal/separador de mobilidade iônica de traveling wave/quadrupolo híbrido. A comparação dos dados de mobilidade obtidos do dispositivo de separação de traveling wave (TWIMS) com aqueles obtidos utilizando vários outros separadores de mobilidade indica que, "embora as características de mobilidade sejam semelhantes, a nova geometria do equipamento híbrido fornece separação por mobilidade sem comprometer a sensibilidade de base do espectrômetro de massas. Esse recurso facilita os estudos relacionados à mobilidade de amostras em níveis analiticamente significativos."

Consulte também:

• Special Feature Perspective: Ion mobility-Mass Spectrometry, A. B. Kanu, P. Dwivedi, M. Tam, L. Matz and H. H. Hill Jr., J. Mass Spectrom. 2008; 43: 1-22 Publicado on-line em Wiley InterScience, (https://onlinelibrary.wiley.com/) DOI: 10.1002/jms.1383
  • Por que essa referência é importante: Uma breve visão geral sobre a mobilidade iônica associada à MS. São fornecidas 160 referências em Espectrometria de Massas de mobilidade iônica (IMMS, Ion Mobility-Mass Spectrometry).
    
• An investigation of the mobility separation of some peptide and protein ions using a new hybrid quadrupole/traveling wave IMS/oa-ToF instrument, S. D. Pringle, K. Giles, J. L. Wildgoose, J. P. Williams, S. E. Slade, K. Thalassinos, R. H. Bateman, M. T. Bowers, J. H. Scrivens, Publicado on-line (www.sciencedirect.com), International Journal of Mass Spectrometry (2006), doi:10.1016/j.ijms.2006.07.021
  • Por que essa referência é importante: Descreve como a IMMS funciona com biomoléculas.