Caracterização de espectros produzidos por dessorção e ionização suave
As reações de retro Diels-Alder e as energias homolíticas/heterolíticas necessárias para desassociar, ou clivar, ligações que levam a uma fragmentação bem caracterizada específica continuam a ser a base para nosso pensamento quando confrontados com espectros de massa. A parte difícil da MS geralmente é responder à pergunta feita por Fred W. McLafferty, um dos colaboradores importantes para nossa compreensão das regras de interpretação: "Com que massa estamos lidando?"
Até o desenvolvimento de técnicas de dessorção, como ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI, Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) e electrospray, pelo menos às vezes essa pergunta parecia mais fácil de responder. A facilidade de utilização dependia da necessidade de derivatização da amostra para torná-la volátil e passível de GC-MS. Aqui, muitas vezes, os espectros seriam dominados pelos grupos derivatizados e mostrariam pouco ou nenhum íon molecular (daí a necessidade de CI). Nesse caso, o advento do electrospray e da APCI certamente ajudou na identificação do peso molecular de espécies de moléculas pequenas carregadas individualmente. Pelo menos nesses casos, a MS lidou com o valor m/z de íons exibindo apenas uma única carga. A massa de um analito geralmente era relatada como a massa nominal (o valor m/z nominal) do íon molecular, o mesmo que a massa nominal da molécula. A massa nominal de um íon, molécula ou radical é a soma das massas nominais dos elementos em sua composição elementar. A massa nominal de um elemento é a massa inteira do isótopo de ocorrência natural mais abundante e estável.
No entanto, a resposta se tornou mais elusiva quando as técnicas de dessorção por ionização suave, como a ionização por electrospray (ESI, Electrospray Ionization), se tornaram comercialmente difundidas no início dos anos 1990. Na era de "pré-dessorção" da MS, a massa nominal da maioria dos analitos interrogados pela MS era inferior a 500 Da. O defeito de massa devido à presença de hidrogênio não era um problema para esses analitos. O limite superior de m/z para a maioria dos espectrômetros de massas ficou no intervalo de 650 a 800. Assim, naqueles dias de ionização pré-dessorção, a massa nominal e a massa monoisotópica inteira tinham o mesmo valor. A massa monoisotópica de um íon, molécula ou radical é a soma das massas monoisotópicas dos elementos em sua composição elementar. A massa monoisotópica de um elemento é a massa exata do isótopo de ocorrência natural mais abundante e estável.
No início da era da ionização por dessorção, moléculas maiores e maior precisão se tornaram parte integrante dos estudos porque a tecnologia permitia isso com pouca dificuldade. Só então a questão do defeito em massa se tornou muito importante. Em um espectrômetro de massas capaz de reportar apenas para o valor inteiro de m/z mais próximo, o íon molecular de um composto C50H102 pode ser representado por um pico em m/z 703 em vez de em m/z 702 porque o íon molecular teria uma massa monoisotópica de 702,7825, que é arredondada para o número inteiro 703.
Acima de 500 Da, o defeito de massa pode ser um problema sério na determinação dos valores m/z dos picos de MS. É importante ter em mente que o espectrômetro de massas está medindo intensidades de sinal que ocorrem em um momento específico durante a coleta do espectro de massas, independentemente do tipo de analisador m/z usado. O valor m/z relatado é uma função do tempo que os íons de um valor m/z conhecido produzidos por um composto específico — em relação ao composto de calibração — chegam ao detector.
Como a massa de íons monoisotópicos muda conforme a posição na escala m/z muda, o espectrômetro de massas que reporta valores m/z inteiros pode realmente fazer medições a cada unidade de 0,05 m/z. A intensidade detectada pode ser aquela no ápice do pico espectral de massa ou a soma das intensidades através do pico espectral de massa. O valor de m/z relatado é um número inteiro obtido arredondando o valor de m/z observado para o pico de espectro de massas máximo.
A MS de ionização de elétrons frequentemente depende de compostos perfluorados, como a perfluorotributilamina (massa molecular nominal de 671) para calibrar a escala de m/z. Isso ocorre porque a massa inteira de um íon é quase a mesma que sua massa monoisotópica. Quando um íon excede uma massa nominal de 1000 Da, não há pico de valor nominal de m/z observado no espectro de massas. O pico de massa monoisotópica é deslocado de onde o pico de massa nominal deve ser observado por uma quantidade igual ao defeito de massa do íon. Para íons de carga única com massas acima de 500 Da, usando técnicas como electrospray com quadrupolo de transmissão ou espectrômetros de massas de captura de íons de quadrupolo que têm resolução de unidade em toda a escala de m/z, os picos de isótopos serão separados claramente.
Das muitas discussões sobre o papel dos isótopos na determinação da identidade de um composto, uma apareceu na revista LCGC Europe que contribui com um equilíbrio útil. "Interpretation of Isotope Peaks in Small Molecule LC–MS" (L.M. Hill, LCGC Europe 19(4), 226–238 (2006) é baseada em um trabalho de captura de íons de baixa resolução. Em uma parte relevante, o autor adverte contra excesso de confiança ao utilizar capturas de íons: "Usuários de capturas de (í)ons terão que ser mais cuidadosos do que aqueles com sistemas QTOF ou triplo quadrupolo. Obviamente, é necessário começar com o pico do isótopo +1 isolado e livre de contaminação... As capturas de íons tendem a capturar com resolução mais baixa do que a varredura... esvazi(ando) a captura... em ordem de massa." Isso não significa que as capturas de íons não possam ser usadas, mas, como todos os equipamentos, devem ser aplicadas com uma compreensão de suas capacidades e limitações.
Da mesma forma, um equipamento capaz de uma resolução muito alta não confere automaticamente a resposta correta. Um conjunto de dados apresentado em um artigo por Kind e Fiehn —T. Kind and O. Fiehn, BMC Bioinformatics 7, 234 (2006) — é particularmente notável e levou à sua conclusão, que se baseou no exame de 1,6 milhão de resultados de pesquisa de fórmulas: "Alta acurácia de massa (1 ppm) e alto poder de resolução não (são) suficientes... apenas um filtro de padrão de abundância isotópica (é) capaz de reduzir o número de candidatos à fórmula molecular." Os espectrômetros de massas capazes de apenas 3 ppm de acurácia de massa, mas de 2% de acurácia do padrão de isótopos, geralmente removem mais de 95% dos falsos candidatos. Esse desempenho superaria até mesmo os espectrômetros de massas capazes de 0,1 ppm — se esses equipamentos realmente existissem — que não são equipados com capacidade de padrão de isótopos.
Entre massas de 150 Da e 900 Da, o número de fórmulas possíveis listadas como acurácia de massa aumentou de 10 ppm para 0,1 ppm sem o auxílio de informações de abundância de isótopos: de um mínimo de 2 fórmulas candidatas a 150 Da para 3447 a 900 Da para 10 ppm. Mesmo na extremidade superior (900 Da), apenas a acurácia de massa a 1 ppm produz 345 candidatos. Invocando 2% de acurácia de abundância de isótopos, o número de candidatos a 900 Da é reduzido a vantajosos 18. Eles também mostram que permitir uma acurácia insignificante de 5% para aquisição de isótopos associada a uma acurácia de 5 ppm produz 196 candidatos.
