Primer sobre cromatografia líquida preparativa

1. Isolamento de antioxidantes utilizando o Sistema Prep 150 LC.
2. Isolamento de peptídeos utilizando o Sistema Prep 150 LC.
3. Purificação de canabinoide do óleo de maconha utilizando o Sistema Prep 150 LC.
4. Isolamento de flavonoides da folha de Ginkgo biloba utilizando o Sistema Waters Prep 150 LC.
5. Isolamento de um produto natural a partir do extrato de equinácea utilizando o Prep 150 LC.
6. Otimização automática do isolamento de compostos com UPLC para cromatografia preparativa utilizando autopurificação direcionada por massa.
7. Isolamento direcionado por massa de um peptídeo sintético utilizando o Detector ACQUITY QDa.
8. Estratégias para melhorar o isolamento utilizando um desenvolvimento de métodos inicial fácil e de grande volume na cromatografia preparativa.
9. Técnicas para melhorar a eficiência de carregamentos de volumes grandes na cromatografia líquida preparativa.
10. Isolamento direcionado por massa de compostos de sulfa a partir de uma mistura de antibióticos com um Detector ACQUITY QDa.
11. Isolamento direcionado por massa de um composto farmacêutico utilizando autopurificação com o Detector ACQUITY QDa.
12. Condições normais de análise e isolamento dos compostos no padrão de mistura da cromatografia preparativa com o Detector ACQUITY QDa.
13. Cromatografia preparativa de extratos de produtos naturais utilizando uma estratégia de purificação Walk-up de Open Access baseada em UV (Ultravioleta, Ultraviolet).
14. Um sistema HPLC preparativo modular para o isolamento de puerarina de extratos de raiz de Kudzu.
15. Aprimoramento sistemático da Resolução e do carregamento da coluna em uma cromatografia líquida preparativa para isolar um componente menor de extrato de hortelã-pimenta.
16. Isolamento de peptídeos e impurezas em pequena escala utilizando os sistemas ACQUITY UPLC H-Class e Gerenciador de frações Waters - Analítico.
17. Purificação em pequena escala de constituintes de extratos de produtos naturais complexos utilizando os Sistemas ACQUITY H-Class e Gerenciador de frações Waters - Analítico.
18. Diluição na coluna, notas de aplicação, Revisão A, Waters Corp, 2003. Para obter mais informações sobre referências e notas de aplicação úteis, acesse o site www.waters.com e coloque os números de referência em azul acima na caixa de pesquisa. 

CONCLUSÃO: 

• Diluição na coluna – técnica de injeção exclusiva que aumenta a capacidade de massa, melhora a resolução, aumenta a vida útil da coluna e melhora a robustez do sistema LC diluindo a amostra em solvente forte no cabeçote da coluna. Cromatograma – uma apresentação gráfica ou outra apresentação da resposta do detector ou outra quantidade utilizada como uma medida da concentração do analito no efluente em relação ao volume ou tempo do efluente. Volume da coluna (V_c), V_c = π x (r)² x Altura x 66% disponível para fase móvel / 1000 para converter mm³ em mL – o volume geométrico da parte da tubulação que contém o preenchimento (área da seção transversal interna da tubulação multiplicada pelo comprimento do leito preenchido, L com compensação para o espaço ocupado pelo material de retenção, 66%), em uma pequena porção do fluxo para o detector, enquanto a porção principal vai para o coletor de frações. O volume morto ainda existe, mas como a concentração da fase móvel é constante, não há diferença observada entre os cromatogramas executados em sistemas de volume morto diferentes. Eluato, eluente, eluir – eluato refere-se à porção do eluente que emerge ou elui da saída da coluna contendo os analitos em solução. Na HPLC analítica, o eluato é examinado pelo detector para a concentração ou a massa de analitos nele. Na HPLC preparativa, o eluato é coletado continuamente em alíquotas, em intervalos de tempo ou volume uniformes, ou descontinuamente apenas quando um detector indica a presença de um pico de interesse. Essas frações são, em seguida, processadas para obter compostos purificados. Hidrofóbico – qualidade de moléculas ou radicais não polares que são mais solúveis em solventes orgânicos do que em água. Cromatografia de troca iônica – a cromatografia de troca iônica (ou cromatografia iônica) é um processo de cromatografia que separa íons e moléculas polares com base na afinidade deles com o trocador iônico. A técnica de separação é utilizada para qualquer tipo de molécula carregada, como proteínas grandes, nucleotídeos pequenos e aminoácidos. Isocrático – a composição da fase móvel permanece constante ao longo de uma separação cromatográfica. Solvente complementar – solvente utilizado para diluir e transferir a amostra dividida do fluxo de preparo para os detectores em um sistema de purificação direcionado à massa. Fase móvel – solventes utilizados para eluir compostos de uma coluna de HPLC. Taxa de fluxo – volume da fase móvel que passa pela coluna por unidade de tempo. Injetor (amostrador automático, gerenciador de amostras) – um mecanismo para introduzir (injetar) de forma exata e precisa um volume predeterminado de uma solução de amostra no fluxo de fase móvel em circulação. Eluição isocrática – a composição da fase móvel permanece constante durante o processo de eluição. Fase móvel – um fluido que se move, em uma direção definida, através do comprimento do leito do sorvente de fase estacionária. Pico – registro da resposta do detector enquanto um único componente é eluído da coluna. Resolução (Rs) – a separação de dois picos, expressa como a diferença em seus respectivos tempos de retenção, dividida pela largura de pico média na linha de base. R_s = 1,25 indica que dois picos de largura igual estão apenas separados na linha de base. Quando R_s = 0,6, a única indicação visual da presença de dois picos em um cromatograma é um pequeno entalhe perto do ápice do pico. Tempo de retenção (RT, Retention time) – o tempo entre o início da injeção ou introdução da amostra e o surgimento do pico máximo. Seletividade – um termo utilizado para descrever a amplitude da diferença entre as afinidades relativas de um par de analitos para as fases móvel e estacionária especificadas que compreendem o sistema de separação. Escala (aumento de escala) – a quantidade de isolado purificado desejada por isolamento determina a escala, o diâmetro da coluna e os requisitos de hardware e do sistema. A quantidade pode variar entre o isolamento ou purificação feitos em pequenas quantidades (µg) de enzimas e em grandes quantidades (kg) necessárias para a operação de fabricação industrial de medicamentos. O aumento de escala é a geração de quantidades maiores de um composto específico para avaliação adicional após uma demonstração inicial de valor potencial. Gradiente por etapas – método de separação que mantém a inclinação antes e depois de uma porção superficial e focada do gradiente, preservando, assim, o perfil cromatográfico para essas partes da separação, que é frequentemente utilizado para determinar o volume morto do sistema. Silanol – grupo químico ligado ao material de retenção da coluna de substrato de sílica que está disponível para interação com a amostra. Divisor – utilizado para desviar uma pequena porção do fluxo da amostra para um detector destrutivo, como na purificação com Espectrometria de Massas. Fase estacionária – um sólido poroso (por exemplo, vidro, sílica ou alumina) que é colocado em uma tubulação de vidro ou metal ou que constitui as paredes de um capilar de tubulação aberta; a fase móvel flui através do leito ou coluna preenchidos, a amostra a ser separada é injetada no início da coluna e é transportada através do sistema pela fase móvel; diferentes substâncias se distribuem de acordo com sua afinidade relativa pelas duas fases. Rendimento – Benefício da operação de separações de LC em velocidades lineares mais altas utilizando colunas analíticas de partículas e volume menores ou colunas preparativas de partículas e volume grandes; resolução, velocidade e eficiência mais altas normalmente proporcionam um rendimento melhor; quantidades maiores de composto podem ser purificadas por corrida ou por período de processo.

GLOSSÁRIO

1. Volume do sistema – volume morto, atraso de volume, volume do sistema a partir do ponto em que os solventes da fase móvel são misturados até atingirem o cabeçote da coluna; em sistemas LC de mistura de alta pressão, os componentes principais incluem o misturador, a tubulação de conexão e o loop do amostrador automático; importância prática apenas para aplicações de gradiente.
2. Razão de separação – a quantidade de material continuamente "removido" e diluído do fluxo de amostra antes da transferência para os detectores durante a purificação direcionada por massa.
3. Cromatografia de exclusão por tamanho – separação de compostos com base em seu tamanho na solução.
4. Gradiente superficial – gradiente no qual a taxa de alteração de concentração de solvente orgânico por volume da coluna é lenta. Utilizado para separar compostos com afinidade semelhante para a matriz da coluna.
5. Gradiente segmentado – método de separação que inclui vários gradientes com diferentes inclinações para separar vários compostos com seletividade diferente com o maior desempenho possível.
6. Sensibilidade (S) – saída de sinal por unidade de concentração ou unidade de massa de uma substância na fase móvel entrando no detector. Em detectores sensíveis ao fluxo de massa, é a razão entre a altura do pico e a unidade de massa.
7. Cromatografia de fase reversa – procedimento de eluição utilizado na cromatografia líquida em que a fase móvel é significativamente mais polar do que a fase estacionária.
8. Fator de retenção (k) – uma medida do tempo em que o componente da amostra reside na fase estacionária em relação ao tempo em que ele reside na fase móvel; ela expressa quanto tempo mais um componente da amostra é retardado pela fase estacionária do que levaria para se deslocar através da coluna com a velocidade da fase móvel.
9. Cromatografia preparativa – o processo de utilização de cromatografia líquida para isolar um composto em uma quantidade e em um nível de pureza suficiente para outros experimentos ou utilizações.
10. Divisor passivo – dispositivo utilizado para fazer a amostragem contínua do fluxo principal ou de preparo com uma razão de separação definida; gerencia o sinal do detector na purificação direcionada por massa.
11. Cromatografia líquida (LC, Liquid chromatography) – técnica de separação em que a fase móvel é um líquido.
12. Entrada – a extremidade do leito da coluna onde o fluxo da fase móvel e a amostra entram.
13. Gradiente – a mudança ao longo do tempo nas concentrações relativas de dois (ou mais) componentes de solvente miscíveis que formam uma fase móvel de força de eluição crescente.
14. Modificador de fase móvel – aditivos misturados aos solventes cromatográficos para melhorar a separação.
15. Capacidade de massa – também chamada de "carga de massa"; quantidade máxima de material que pode ser injetada em uma coluna de modo que a resolução do composto de interesse seja adequadamente mantida.
16. Gradiente linear – método de separação cromatográfica que altera a composição da fase móvel a uma taxa constante ao longo de um período de tempo definido.
17. Ionização – processo pelo qual uma molécula adquire uma carga negativa ou positiva ganhando ou perdendo elétrons para formar íons.
18. Hidrofílico – dissolve-se ou interage prontamente com água ou solventes polares devido à presença de grupos polares fortes.
19. Equilíbrio – nos métodos cromatográficos nos quais um gradiente é empregado, o tempo de equilíbrio pós-corrida necessário para retornar a coluna e o sistema às condições iniciais de fase móvel antes da próxima injeção. Para atingir um equilíbrio adequado, a coluna deve ser lavada com 5 vezes o volume total da coluna (CV, Column Volume), mais 3 vezes o volume do sistema (morto) nas condições iniciais do método. Reequilíbrio de coluna cromatográfica de gradiente, perspectivas de desempenho, Waters Corp. 1998. Inclinação do gradiente – a taxa de alteração na composição do solvente orgânico por volume de coluna durante uma separação por gradiente.
20. Eficiência – uma medida da capacidade de uma coluna de resistir à dispersão de uma faixa de amostra à medida que ela passa através do leito preenchido. Uma coluna eficiente minimiza a dispersão ou a expansão de faixas. Uma maior eficiência é importante para uma separação eficaz, maior sensibilidade e/ou identificação de componentes semelhantes em uma mistura complexa de amostras.
21. Volume morto – volume do sistema a partir do ponto em que os solventes da fase móvel são misturados até atingirem o cabeçote da coluna; em sistemas LC de mistura de alta pressão, os componentes principais incluem o misturador, a tubulação de conexão e o loop do amostrador automático; quando os componentes da fase móvel são misturados on-line para separações isocráticas.
22. Detector – um dispositivo que indica uma alteração na composição do eluente medindo propriedades físicas ou químicas (por exemplo, absorbância de luz UV/visível, índice de refração diferencial, fluorescência ou condutividade). Alguns detectores (por exemplo, eletroquímicos, de Espectrometria de Massas) são destrutivos; ou seja, eles realizam uma mudança química nos componentes da amostra. Se um detector for destrutivo para a amostra, um divisor será utilizado para desviá-la.
23. Cromatografia – um método de separação no qual os componentes a serem separados são distribuídos entre duas fases, uma das quais é estacionária (a fase estacionária), enquanto a outra (a fase móvel) se move em relação à fase estacionária.
24. Cromóforo – parte de uma molécula que absorve certos comprimentos de onda da luz visível e transmite ou reflete outros. O cromóforo é uma região na molécula onde a diferença de energia entre dois orbitais moleculares diferentes está dentro do intervalo do espectro visível. A luz visível que atinge o cromóforo pode, assim, ser absorvida excitando um elétron de seu estado fundamental para um estado excitado.

REFERÊNCIAS

• A cromatografia preparativa tornou-se uma técnica de valor inestimável para a fabricação de produtos farmacêuticos, isolamento de produtos naturais e outras operações importantes onde a geração de material purificado é necessária. O aproveitamento de todo o potencial da técnica é diretamente proporcional à qualidade do desenvolvimento do método. Uma vez que um sistema de purificação tenha sido equipado com o hardware e o software apropriados para purificação em grande escala, a transferência de métodos de pequena para grande escala torna-se uma questão de rotina. 
  • Sarker, S., Latif, Z., Gray, A., "Natural Products Isolation" Second Edition. Humana Press. 2006.
  • Aubin, A. "UV-Directed Purification of a Small-Scale Organic Synthesis", Waters Corporation, Milford, MA, EUA. 2008.
  • Diehl, D. Fountain, K. Wheat, T. Joblonski, J. Yin, Z. Morrison, D; Collier, S. Murphy, B. Cleary, R. Compagnon, L., "Practical Chemistry Considerations for Purification." Apresentação da Waters. 2008.
  • Dolan, J. "A Guide to HPLC and LC-MS Buffer Selection." Advanced Chromatography Technologies. www.ace-HPLC.com.
  • Jablonski, J et.al. "Effective Use of Temperature Control in Compound Isolation." Waters Corporation, Milford, MA, EUA.
  • "At-Column-Dilution, Application Notes", Waters Corp, 2003.
  • Para obter mais informações sobre Referências e notas de aplicação úteis, acesse o site www.waters.com e coloque os números de referência em azul acima na caixa de pesquisa.