Primer sobre cromatografia líquida preparativa

A injeção de amostras pode ser realizada manualmente para um rendimento baixo ou ser automatizada para aplicações de alto rendimento. Na injeção manual, uma válvula Rheodyne equipada com um loop de injeção é removida do caminho do fluxo girando uma alavanca da válvula. Uma amostra filtrada é aspirada para uma seringa, uma ponta de agulha cega é conectada e as bolhas de ar são removidas. A agulha é inserida na porta de injeção de amostras, e a amostra é dispensada no loop de injeção. A alavanca da válvula Rheodyne é girada para colocar o loop de injeção de volta no caminho do fluxo. Nessa posição, a amostra é colocada no caminho do fluxo.

A injeção de amostra também pode ser automatizada para um rendimento alto. Amostradores automáticos de alta capacidade podem gerenciar a aspiração e a injeção de amostras em uma única plataforma. Um braço robótico é configurado no software de purificação para controlar a injeção de amostras a partir de placas de microtitulação, tubos de ensaio, vials de cintilação ou vials de amostrador automático convencionais.

Loops de injeção

Normalmente, um loop de injeção é selecionado com base no tamanho do volume de injeção pretendido. Quando o volume do loop é muito grande, a amostra pode absorver a área de superfície em excesso do loop, causando um atraso, ou pode ocorrer dispersão da amostra — e ambos os casos podem afetar negativamente a qualidade da cromatografia. Um tamanho de loop próximo ao volume de injeção pretendido fornece a melhor reprodutibilidade e o melhor perfil cromatográfico.

Coletores de frações

O rendimento desejado para a aplicação determina o nível de automação necessário para a coleta de frações. Um coletor de frações consiste em uma chave e uma válvula de desvio de amostra. A válvula de desvio é aberta no momento apropriado para permitir que os compostos sejam coletados à medida que eluem.

Embora a coleta de frações possa ser realizada manualmente em aplicações de baixo rendimento, também é possível automatizá-la para obter um rendimento mais alto. O nível de automação é determinado pelo número e volume de frações desejadas. Geralmente, os coletores de frações de alto rendimento combinam a injeção de amostra e a coleta de frações na mesma mesa de trabalho utilizando um braço robótico equipado com probes de coleta de amostras e frações.

Recipientes de coleta

Muitos sistemas de purificação podem acomodar uma ampla variedade de formas, tamanhos e volumes de recipientes de coleta. Os recipientes de coleta mais comuns incluem tubos de ensaio, vials, frascos ou funis que dispensam em recipientes grandes. Os recipientes de coleta precisam estar limpos, secos e inertes quando expostos à amostra e ao solvente. Normalmente, eles são colocados no leito de coleta do recipiente sem uma tampa superior para acomodar a administração do isolado.

Em alguns sistemas de coleta, as frações que não são coletadas não vão para o descarte e podem ir para um recipiente de descarte de amostras específico. Se o usuário coletar o pico incorreto, executar um método inadequado, não conseguir detectar o destino ou ocorrer uma falha no acionamento da coleta, elas fluirão para um recipiente de descarte especial, no qual o solvente pode ser evaporado e a amostra pode ser dissolvida e injetada novamente.

Detectores

Considerações especiais devem ser dadas à detecção ao realizar cromatografias de purificação. Os quatro principais tipos de detectores utilizados para purificação são: UV/Vis, Índice de refração (RI, Refractive Index), Espalhamento de luz evaporativa (ELS, Evaporative Light Scattering) e Espectrometria de Massas (MS, Mass Spectrometry).

Os detectores podem detectar em um único comprimento de onda, que pode ser definido pelo usuário (UV/Vis), ou a absorbância em uma faixa de comprimento de onda pode ser coletada por um detector de arranjo de fotodiodos (PDA, Photodiode Array). Com frequência, o PDA é utilizado durante o desenvolvimento de métodos para selecionar um comprimento de onda adequado ao composto de interesse. Isso é realizado coletando comprimentos de onda entre 200 e 400 nm ou superiores (≥350 nm) ao trabalhar na faixa visível. O comprimento de onda ideal para o isolamento é aquele que fornece a intensidade máxima de sinal para o composto de interesse. Também é preciso determinar o comprimento de onda ideal para impurezas perto da eluição. Caso contrário, um "isolado puro" coletado em um comprimento de onda pode, na verdade, conter impurezas quando observado em um comprimento de onda diferente. Quando isso ocorrer, talvez seja necessário um desenvolvimento de método secundário e purificação para purificar ainda mais o isolado.

Ao utilizar detectores UV/Vis e PDA, a alta sensibilidade pode ser um obstáculo para grandes volumes de injeção e elevadas concentrações de amostra, comuns durante a purificação. Como resultado, são utilizadas células de fluxo do detector com comprimentos de caminho curtos (1-3 mm) em vez de células de fluxo analíticas com comprimentos de caminho longos (10 mm).

Os detectores de RI oferecem algumas vantagens para a detecção de componentes com pouca ou nenhuma absorção de UV, como álcoois, açúcares, sacarídeos, ácidos graxos e polímeros. O detector de RI detecta diferenças no índice de refração para determinar a presença ou a ausência de um composto. Às vezes, o detector de RI é chamado de detector "universal" porque não depende do composto ionizado ou contendo um cromóforo. Uma desvantagem do detector de RI é que ele só pode ser utilizado em separações isocráticas, para evitar a detecção de distúrbios de gradiente que causam deslocamento da linha de base.

Os detectores ELS podem ser utilizados como uma alternativa aos detectores UV/Vis e de RI. Os detectores ELS funcionam passando o eluato através de um nebulizador aquecido para volatilizar o analito e evaporar o solvente. O solvente é transportado como gás, mas o analito forma um fluxo de partículas finas, que passa entre uma fonte de luz e um detector que espalha a luz e mede o efeito. As principais vantagens dos detectores ELS são que eles detectarão compostos que não possuem um cromóforo e podem ser utilizados em separações isocráticas e de gradiente. Uma desvantagem é que os detectores ELS destroem as amostras e, por isso, não podem ser colocados em linha com o caminho do fluxo principal. O caminho do fluxo deve ser dividido de modo que uma pequena proporção vá para o detector ELS e o resto vá para o coletor de frações.

Os detectores de MS identificam os compostos da amostra separados que emergem da coluna com base na massa e no espectrômetro de massas. A MS é um dos métodos mais sensíveis e altamente seletivos de análise molecular e fornece informações sobre o peso molecular, bem como o padrão de fragmentação da molécula do analito, inestimável para confirmar a identidade do analito. Vários tipos de sistemas MS que incorporam diferentes tipos de interfaces estão disponíveis. Os mais populares são electrospray (ESI, Electrospray) e ionização química à pressão atmosférica (APCI, Atmospheric Pressure Chemical Ionization). Cada interface está associada a diferentes campos de aplicabilidade, capacidade de taxa de fluxo, sensibilidade e linearidade de resposta. Como acontece com os detectores ELS, a MS é uma técnica destrutiva. Portanto, o fluxo deve ser dividido de maneira que uma pequena porção entre no detector e a parte principal, no coletor de frações.

Divisores de fluxo

Em detectores quimicamente destrutivos, como em MS ou ELS, uma porção do fluxo proveniente da coluna deve ser separada do fluxo principal e direcionada ao detector para acionamento da fração. Como os detectores devem detectar um pico antes que o coletor de frações seja acionado (tempo de atraso), o fluxo de separação deve chegar ao detector antes que o fluxo principal chegue ao coletor de frações. Para isso, a velocidade do fluxo de separação é aumentada utilizando uma "bomba de complementação" e um "solvente complementar".

Os divisores de fluxo podem ser "passivos" ou "ativos". Ambos são igualmente eficazes na coleta do fluxo da amostra, de modo que o tipo de divisor utilizado depende da preferência do usuário.

Os divisores passivos envolvem a utilização de tubulação restritiva, como uma bobina de atraso e "conexões T", para manter um intervalo de taxa de fluxo e uma razão de separação específicos.

Um divisor de fluxo ativo tem dois caminhos de fluxo completamente separados e uma válvula de alternância rápida que transfere uma parte do fluxo principal para o fluxo complementar, onde ela é diluída em uma razão de separação programada.

Tubulação

Ao decidir qual tubulação apropriada deve ser utilizada no caminho de fluidos, várias considerações devem ser feitas. Em primeiro lugar, garantir a integridade da tubulação do caminho do fluxo do sistema depende, em grande medida, da adequação do material a partir do qual a tubulação é feita e da aplicação. A tubulação pode ser feita de PEEK (Poliéter-éter-cetona, Polyether Ether Ketone), que é um polímero de engenharia de alto desempenho, ou de aço inoxidável — e deve ser quimicamente compatível com a amostra e a fase móvel para evitar a adesão da amostra à superfície da tubulação, o que causa perda de amostra e baixo rendimento ou carryover.

A tubulação do sistema também deve ser capaz de resistir às pressões e às temperaturas operacionais do caminho do fluxo — embora, com a cromatografia de purificação, o controle de temperatura do caminho de fluidos não seja utilizado com frequência e, portanto, não seja um problema significativo.

Em termos de limitações de pressão, é possível separar os sistemas de purificação cromatográficos em três zonas: a zona de "baixa pressão" entre o reservatório de solvente e a bomba; a zona de "alta pressão" entre a bomba e a entrada da coluna; e uma segunda zona de "baixa pressão" entre a saída da coluna e o reservatório de descarte ou coletor de frações após o detector. A tubulação em cada zona tem requisitos exclusivos de retenção de pressão. A seleção de um material de tubulação inadequado em uma zona de pressão com requisitos críticos pode levar não apenas a problemas cromatográficos e de baixo desempenho, mas também a vazamentos e rupturas.

Duas variáveis devem ser consideradas: o diâmetro interno e o comprimento da tubulação. Geralmente, quanto menor o diâmetro interno, maior é a velocidade interna e menor é a dispersão da amostra, permitindo que a amostra permaneça o mais concentrada possível. No entanto, conforme o diâmetro da tubulação interna diminui, a pressão criada pela tubulação pode aumentar significativamente, resultando possivelmente em uma contrapressão do sistema incompatível com a célula de fluxo do detector ou com outros componentes do sistema. Quando tubulações com diâmetros internos diferentes são conectadas, um volume inativo pode se formar na junção ou perto dela. Esse volume inativo pode causar problemas de formato de pico e carryover, pois os volumes não são adequadamente varridos pelo fluido ou fase móvel.

Ao considerar o comprimento da tubulação, quanto maior for a produção do volume do caminho do fluxo, maior será a oportunidade de a amostra se diluir na fase móvel e de componentes separados se mesclarem novamente. O comprimento da tubulação também pode contribuir com as pressões, atrasos de volume e volumes extracoluna do sistema. Para evitar esses problemas, o comprimento da tubulação.

Em geral, os sistemas de purificação preparativos em grande escala operam em taxas de fluxo altas. Para moderar a contrapressão causada por essas taxas de fluxo, é importante conectar o sistema de purificação com uma tubulação de diâmetro apropriado para garantir resultados cromatográficos de alta qualidade. Há vários diâmetros de tubulação disponíveis para taxas de fluxo de 0,05 mL/min a 130 mL/min.