Primer sobre cromatografia líquida preparativa

Separações complexas são mais afetadas pela seletividade do material de retenção da coluna. No entanto, ao desenvolver um método de separação direcionado para a purificação, é mais eficiente começar com a otimização da separação de amostras gerada com um gradiente de verificação rápida. O objetivo dos gradientes de verificação é determinar a concentração aproximada de solvente necessária para eluir o(s) composto(s) de interesse da coluna. Normalmente, gradientes de verificação começam com a mesma concentração de solvente forte (2% a 10%) e aumentam linearmente até 25%, 75%, 50% e de 90% a 95%.

Após a conclusão dos gradientes de verificação, os resultados são revisados e avaliados por uma série de perguntas antes de prosseguir para a próxima etapa:

• O gradiente de verificação rápida fornece separação adequada para o composto de interesse?
• O gradiente de verificação rápida é adequado em termos de velocidade ou eficiência?
• A separação do composto de interesse de outros picos pode ser mantida na carga de amostra necessária?

Caso o gradiente de verificação não produza um resultado adequado, ele pode ser otimizado por meio de ajustes no foco do método. Como alternativa, a separação pode ser totalmente modificada através de pH, solvente ou outras variáveis cromatográficas.

Otimização do método

É possível otimizar a corrida de verificação que fornece a maior resolução para o composto de interesse por meio da modificação da composição de solventes fortes e fracos. A composição pode permanecer constante (isocrática) ou ser alterada por uma determinada unidade de tempo ou volume da coluna (gradiente).

Eluição isocrática

Em uma separação isocrática, o solvente fraco e o solvente forte são mantidos em uma razão imutável por unidade de tempo. O solvente isocrático pode ser preparado off-line pelo analista ou misturado on-line com uma bomba de HPLC capaz de dosar os diferentes solventes a uma taxa consistente e predeterminada. Esse modo de eluição é conveniente, consistente e robusto porque as influências do tempo de retenção causadas pelo volume morto são insignificantes ao transferir um método entre sistemas.

A eluição isocrática tem desvantagens e pode não ser apropriada para todas as separações. Há problemas inerentes, incluindo resolução insuficiente de picos de eluição iniciais, diminuição da simetria devido a assimetria de pico, diminuição da sensibilidade devido a alargamento da faixa e problemas com a contaminação da coluna devido ao acúmulo de compostos fortemente retidos.

Eluição por gradiente

As separações de gradiente em fase reversa ou troca iônica envolvem, geralmente, a mistura on-line da fase móvel para obter um aumento constante no solvente orgânico ao longo da análise. No início do gradiente, quando a força do solvente é baixa, o analito é particionado na fase estacionária ou permanece no cabeçote da coluna. À medida que a força do solvente aumenta, o analito é transferido para a fase móvel, move-se ao longo da coluna e, finalmente, é eluído.

A eluição por gradiente oferece a capacidade de separar analitos com uma ampla faixa de hidrofobicidade em um período de tempo razoável. Vantagens adicionais podem incluir a resolução de pico aprimorada e uma sensibilidade maior devido à maior altura de pico. A deterioração da coluna também é minimizada quando os componentes fortemente retidos são lavados da coluna no final da corrida.

Também há desvantagens ao utilizar a eluição por gradiente. É necessária uma mistura de gradiente on-line consistente e sem pulso — portanto, muitas vezes, é necessário um equipamento de bomba caro. Além disso, pode ocorrer precipitação quando algumas fases móveis são misturadas em determinadas combinações. Os tempos de corrida podem ser longos devido ao reequilíbrio pós-gradiente, e o tempo de espera (Vd) dos equipamentos pode variar, causando problemas de transferência de método, sem compensação adequada.

Gradiente linear

Os gradientes lineares progridem com um aumento constante na composição de solvente forte ao longo de toda a corrida. Com frequência, eles são utilizados em experimentos de screening rápido para determinar rapidamente a razão de solvente que elui o pico de interesse e mantém o tempo de corrida razoavelmente curto. O resultado é uma diminuição no tempo de eluição e nos custos de solventes.

Gradiente segmentado

Um gradiente segmentado é a combinação de uma série de gradientes lineares, cada um com uma inclinação diferente. Os segmentos superficiais separam os compostos de interesse; já os segmentos íngremes são áreas do cromatograma em que uma resolução alta não é necessária, como em uma lavagem pós-separação.

Normalmente, gradientes focados são mais curtos e mais exagerados do que em gradientes segmentados. A força do solvente, em geral, é muito baixa imediatamente após a injeção. Ela é, então, aumentada rapidamente para entre 2 e 5% abaixo da razão de solvente necessária para eluição do composto de interesse (ou seja, 22% de concentração de eluição – 2% = 20%; início do gradiente superficial). Um gradiente superficial prossegue em cerca de 1/5 da inclinação determinada na separação de verificação rápida; finalmente, ele termina entre 2 e 5% acima da concentração de eluição para o composto de interesse (ou seja, 22% + 2% = 24%; término do gradiente superficial). Por fim, a porcentagem de solvente é aumentada rapidamente para lavar a coluna de qualquer componente restante da amostra.

Desenvolvimento de um gradiente focado

Os cálculos a seguir podem ser utilizados para gerar um gradiente focado para o composto de interesse após a amostra ter sido analisada com um gradiente de verificação rápida. Cada equação é seguida por um exemplo teórico.

Primeiro, é necessário determinar o volume morto do sistema para o equipamento que foi utilizado na corrida do gradiente de verificação. As instruções para determinação de volume morto podem ser encontradas na seção deste primer intitulada "Determinação do volume morto" ou na ferramenta de aplicativo "Calculadora de gradiente analítico a preparativo", em www.waters.com/prepcalculator.

Além disso, o volume da coluna também deve ser determinado para a coluna utilizada na corrida de verificação. Ele pode ser calculado utilizando o volume de um cilindro V = πr²h e a compensação para o volume ocupado pelo material de retenção, ou seja, V = πr²h (66%). A ferramenta de aplicativo "Calculadora de gradiente analítico a preparativo" também pode ser utilizada para fazer esse cálculo.

Equação 1: Volume da coluna

Volume da coluna = π r² x Altura x 66% disponível para fase móvel / 1000 para converter mm³ em mL

Exemplo:

CV = 3,14 x (4,6 mm/2)² x 50 mm x 0,66 / 1000
CV = 548 mm³ = 0,548 mL

Equação 2: Volume de deslocamento entre a formação de gradiente e o detector

Volume de deslocamento = Volume do sistema* + volume da coluna
*Volume do sistema ou volume morto

Exemplo:

Volume de deslocamento = 1,04 mL + 0,548 mL
Volume de deslocamento = 1,588 mL

Equação 3: Tempo até chegar ao detector

Tempo até chegar ao detector = Deslocamento em mL / Taxa de fluxo em mL/min

Exemplo:

Tempo até chegar ao detector = 1,588 mL/1,5 mL/min
Tempo até chegar ao detector = 1,06 min

Equação 4: Tempo em que a concentração de eluição foi formada

Tempo de eluição da concentração = Tempo de retenção do pico de interesse – Tempo até chegar ao detector – Retenção de gradiente

Exemplo:

Tempo de concentração de eluição = 6,0 min – 1,06 min – 0,0 min
Tempo de concentração de eluição = 4,94 min

Equação 5: Percentual de concentração de eluição

% de concentração de eluição = Tempo de concentração de eluição / Intervalo do segmento de gradiente de verificação x Verificação de alterações + % de gradiente de verificação inicial

Exemplo:

% de concentração de eluição = 4,94 min / 6,0 min x 90% + 5%
% de concentração de eluição = 79,1%

Equação 6: Número de volumes de coluna (CV, Column Volumes)

Nº de volumes de coluna = 1 volume de coluna/mL x Fluxo em mL/min x Intervalo do segmento de gradiente de verificação

Exemplo:

Nº de CV = 1 CV / 0,548 mL x 1,5 mL/min x 6 min
Nº de CV = 16,4

Equação 7: Inclinação do gradiente de verificação

Inclinação do gradiente de verificação =% de alteração do gradiente de verificação / nº de volumes de coluna

Exemplo:

Inclinação do gradiente de verificação = (95% - 5%) / 16,4 CV
Inclinação do gradiente de verificação = 5,49% / CV

Equação 8: Inclinação do gradiente focado

Inclinação do gradiente focado = 1/5 x inclinação do gradiente de verificação

Exemplo:

Inclinação do gradiente focado = 1/5 x 5,49% / CV Inclinação do gradiente focado = 1,1% / CV

O segmento de gradiente focado é criado de 5% abaixo a 3-5% acima da porcentagem de eluição estimada. A título de exemplo, a porcentagem de eluição é de 79%.

Equação 9: Intervalo de tempo para o segmento de gradiente focado

Intervalo de tempo para o segmento de gradiente ficado = % do intervalo x (1 / inclinação do gradiente de verificação) x volume da coluna x (1 / taxa de fluxo)

Exemplo:

Intervalo de tempo para o segmento de gradiente focado = (79% + 5%) - (79% - 5%) x (1 / 1,1%) x (0,548 mL) x (1 / 1,5 mL/min) Intervalo de tempo do segmento de gradiente focado = 3,32 min

A última etapa é escrever o gradiente focado utilizando os valores calculados nas fórmulas anteriores.