Primer sobre cromatografia líquida preparativa

A cromatografia é definida como a separação de uma mistura com base nos atributos químicos dos componentes dessa mistura. A cromatografia preparativa (Prep) ou de purificação é definida como o processo de utilização de cromatografia para isolar um composto em uma quantidade e em um nível de pureza suficiente para outros experimentos ou processos. Um cientista define um composto de interesse e, em seguida, desenvolve um método para separar e isolar com êxito esse composto a partir de materiais de partida, reações colaterais ou outras impurezas. O objetivo geral é atender às demandas crescentes por alto rendimento e produtividade — e, ao mesmo tempo, adaptar as técnicas de purificação para satisfazer os requisitos adequados de escala, pureza e reprodutibilidade.

A cromatografia de purificação é utilizada em muitos ambientes científicos, de grandes organizações farmacêuticas a pequenos grupos de pesquisa de produtos naturais. Embora as áreas de aplicação possam ser diferentes, os requisitos gerais do usuário são bastante semelhantes, com um nível de pureza final desejado de 95% ou mais para o isolamento desejado.

A intenção deste primer é fornecer aos cientistas que utilizam a cromatografia líquida uma introdução sobre a purificação LC (Cromatografia líquida, Liquid Chromatography), um campo em rápida expansão. Serão apresentados princípios fundamentais, como o desenvolvimento de um método de separação cromatográfica, as equações matemáticas necessárias para o aumento de escala do método e modos comumente utilizados na coleta de frações. A fase reversa é o principal modo de separação discutido, pois ele é utilizado na maioria das aplicações de LC preparativa.

O sucesso de um isolamento de purificação é determinado pelo rendimento, pela recuperação e pela pureza do isolado obtido. O isolamento é conduzido pela separação de pico ou "resolução". Os seguintes parâmetros cromatográficos têm o impacto mais significativo na resolução:

• Material de retenção da coluna (fase estacionária)
• Força do solvente

As condições que fornecem uma resolução ideal são determinadas pela execução de uma rotina de trabalho de desenvolvimento de métodos. A rotina de trabalho é bastante simples, mas consiste em várias etapas, variando em complexidade e necessidade de acordo com as propriedades exclusivas de cada amostra. Não importa a aplicação ou o modo de separação da amostra (ou seja, fase reversa, troca iônica, etc.), a rotina de trabalho geralmente será a mesma.

Antes de planejar uma rotina de trabalho, o fator mais importante a ser considerado é a natureza do composto-alvo. Ao isolar um composto conhecido da mesma fonte ou de uma nova fonte, é fácil obter informações da literatura sobre o comportamento cromatográfico do composto-alvo, e é possível selecionar o método apropriado, sem dificuldade, entre os publicados anteriormente. No entanto, é mais difícil projetar um protocolo de isolamento para um extrato bruto, onde os tipos de compostos são desconhecidos. Nesse caso, é possível realizar uma série de experimentos exploratórios após o isolamento inicial para aprender mais sobre o composto de interesse, como pK_a, peso molecular, solubilidade, estabilidade, espectros de UV e atividade biológica. A partir dessas informações, o método de separação inicial pode ser modificado para atender aos requisitos químicos e físicos do composto. Essas informações não são apenas úteis no desenvolvimento de métodos, mas também são valiosas após a coleta, quando a estabilidade do produto isolado se torna importante.

A primeira etapa é preparar uma amostra e realizar uma separação geral utilizando um gradiente de verificação rápida. Normalmente, isso é executado em uma escala pequena, para conservar material de amostra precioso. A partir dessa separação, a condição do solvente que elui o composto de interesse pode ser calculada, e as condições de separação ainda mais otimizadas para maximizar a resolução. Também é possível conduzir um estudo de carregamento para determinar a quantidade de amostra que pode ser carregada sem afetar a resolução adequada para produzir um isolado altamente puro.

Depois de definir o método de separação e a carga de amostra desejada, o aumento de escala do método é frequentemente realizado, embora nem sempre, para qualquer isolado com valor potencial ou promissor. Para os fins deste primer, o termo "escala" descreve os equipamentos e a metodologia necessários para atender às metas de pureza, produção e rendimento da aplicação. Quando é feito um "aumento de escala" do método, ele é movido para um sistema com hardware adequado para lidar com cargas de amostra maiores. Essencialmente, o aumento de escala envolve a mudança de uma coluna de diâmetro analítico para uma de diâmetro preparativo, mantendo a resolução por meio de uma série de cálculos de aumento de escala e mudanças de hardware.

Amostras

As amostras a partir das quais um composto específico pode ser isolado vêm de uma ampla variedade de fontes, incluindo intermediários de medicamentos, produtos naturais, nutracêuticos, bebidas ou produtos industriais. Contanto que um material possa ser extraído e dissolvido em uma matriz líquida, os componentes individuais podem ser purificados utilizando cromatografia.

As técnicas utilizadas para extração de amostras dependem da complexidade do material do qual elas são extraídas. No caso de produtos naturais, normalmente, a amostra é seca e moída em partículas finas para aumentar a eficiência da extração. Em seguida, uma técnica como percolação, para tamanhos de amostra grandes, ou maceração, para tamanhos de amostra pequenos, pode ser utilizada para extrair os compostos de interesse. Ambas as técnicas envolvem adicionar um solvente ao material da amostra e coletar o soluto após sonicação, turbilhonamento ou imersão. Depois que o extrato é coletado, como acontece com todas as amostras de HPLC, ele deve ser filtrado para remover particulados e eliminar bolhas antes da injeção.

Modos de separação

Existem quatro modos principais de separação utilizados na cromatografia preparativa. São eles: a fase reversa, a fase normal, a permeação em gel e a troca iônica. O modo de separação apropriado é determinado pela compatibilidade da fase estacionária e dos solventes com a amostra, extrato ou mistura sob análise.

A fase reversa, a técnica mais comum utilizada no desenvolvimento de purificação, utiliza uma fase estacionária que é menos polar do que o solvente de eluição. O eluente é uma mistura de água e acetonitrila ou metanol, enquanto tampões (ácidos ou bases) são adicionados para controlar o grau de ionização da amostra e ocupar grupos silanóis não reagidos presentes na fase estacionária. Os materiais de fase ligada ou sorventes em fases estacionárias à base de sílica são derivatizados com reagentes de alquilsilila para reduzir a assimetria de pico e melhorar a reprodutibilidade cromatográfica. O grau de carregamento de carbono com esses reagentes derivatizados (silianização) pode dar às colunas feitas por diferentes fabricantes características de separação exclusivas.

Desenvolvimento de métodos de início rápido

Para estabelecer uma separação de fase reversa, geralmente uma coluna analítica de pequena escala (≤ 4,6 mm de diâmetro) é selecionada com comprimento e material de retenção disponível em grande escala (≥ 10 mm de diâmetro), para facilitar o aumento de escala futuro. É fundamental identificar o sistema de solventes correto para obter uma separação ideal. Geralmente, para compostos ácidos uma fase móvel aquosa é preparada em um pH ácido; já o metanol ou a acetonitrila são preparados como o solvente forte. O ácido fórmico, igual a 0,1% por concentração, é um aditivo tampão comumente utilizado por ser compatível com UV e Espectrometria de Massas. A compatibilidade de MS é útil na identificação de compostos desconhecidos e no preparo de um isolado purificado para estudos posteriores. Uma fase móvel de pH básico pode ser utilizada em vez de pH ácido para manter a forma não ionizada de moléculas básicas. Antes de utilizar um tampão de qualquer pH, consulte o folheto informativo sobre a fase estacionária da coluna para verificar a compatibilidade.

Normalmente, a fase móvel aquosa é colocada na posição de bomba A e o solvente forte na posição de bomba B. "A" e "B" serão utilizados em todo este primer para se referir a solventes aquosos e fortes nas tabelas de bomba, respectivamente.