Primer sobre cromatografia líquida preparativa

Após um método de separação ter sido desenvolvido e ampliado para a escala desejada, a etapa final é isolar ou coletar o composto de interesse. As frações podem ser coletadas manualmente pelo operador, conforme a eluição de pico é monitorada, ou pode ser automatizada com base no sinal do detector ou no tempo de retenção.

Tempo de atraso da fração

A coleta de frações ocorre quando o detector vê um pico que atende aos critérios de acionamento de coleta definidos pelo usuário. Quando o pico está presente no detector, ele ainda não se deslocou para o coletor de frações. Se um coletor de frações for acionado muito cedo, o pico será perdido pelo coletor de frações. Um tempo de atraso de fração específico do sistema deve ser determinado com antecedência para cronometrar corretamente a coleta de frações. Um método de calibração envolve a injeção de um corante concentrado e a comparação do tempo que ele leva para ser visto pelo detector com o tempo decorrido até chegar ao coletor de frações. Geralmente, a calibração do tempo de atraso da fração é um processo único e, uma vez inserida no software, pode ser recalculada para qualquer taxa de fluxo. O tempo de atraso da fração deve ser recalibrado quando são feitas alterações no caminho do fluxo do detector até o coletor de frações, como ao adicionar um divisor de fluxo.

Coleta manual de frações

A coleta manual é bastante simples e fácil. O usuário aciona a alternância da válvula de desvio no coletor de frações enquanto a eluição do composto é monitorada visualmente por meio de um gráfico de sinal em tempo real do software on-line do equipamento. A coleta manual de frações fornece a maior flexibilidade porque apenas as partes desejadas da corrida de purificação são coletadas, mas o rendimento tende a ser baixo devido à falta de automação.

Coleta de frações baseada em pico

O acionamento baseado em pico é uma forma automatizada de coletar frações com base no sinal de um detector. Os parâmetros utilizados para decidir se um pico no cromatograma deve acionar o coletor de frações são, geralmente, altura do pico, limiar e/ou inclinação.

A abordagem mais comum para coleta de frações baseada em pico utiliza a altura ou o limiar. Assim que um sinal atinge uma altura predefinida do detector, a coleta de frações é acionada. Quando o sinal cai abaixo de uma altura predefinida, a coleta é interrompida.

Em geral, a coleta de frações por inclinação é um método de coleta mais desafiador, mas pode ser utilizada para coletar picos que não são separados pela linha de base. Ao coletar por inclinação, a coleta de frações é acionada automaticamente pelo software em pontos matemáticos de inflexão detectados ao longo da primeira derivada do cromatograma.

Coleta de frações por detecção de massas

Na coleta de frações baseada em massa, apenas os compostos com a massa desejada, definida pelo usuário, são coletados. Como resultado, a coleta por massa pode ser mais eficiente do que a coleta baseada em pico. Os requisitos para a coleta de frações baseada em massa podem ser resumidos da seguinte maneira:

• A massa molecular do composto deve ser conhecida.
• O composto deve ser ionizado para a detecção de massas.

Análise de fração

Depois que as frações são coletadas, é possível analisá-las diretamente no recipiente de coleta ou remover o solvente para produzir o produto purificado. Um evaporador rotativo (rotavapor) pode ser utilizado para secar a fração. Com essa ferramenta, o solvente é evaporado da amostra e a porção aquosa é liofilizada. Se tampões inorgânicos tiverem sido utilizados ou se a porção aquosa for particularmente grande, a fração poderá ser passada através de um cartucho de SPE de fase reversa para reter os compostos-alvo (ou seja, conhecido como dessalinização). Os compostos presos são, então, eluídos com uma pequena quantidade de solvente orgânico, que pode ser evaporado mais facilmente.

Uma estimativa de recuperação pode ser determinada por análise de fração utilizando várias técnicas analíticas de rotina, como; UV (Ultravioleta, Ultraviolet), IR (Infravermelho, Infrared), MS (Espectrometria de Massas, Mass Spectrometry), NMR (Ressonância magnética nuclear, Nuclear Magnetic Resonance), raio-X, ensaio e/ou elucidação da estrutura. Quando um padrão está disponível, é fácil fazer uma comparação direta do isolado com os dados da literatura. No entanto, se o composto-alvo for desconhecido, será necessária uma abordagem sistemática ampla e abrangente, envolvendo uma variedade de técnicas físicas, químicas e espectroscópicas, para estabelecer um perfil de pureza e estabilidade.

Equação 14: % de recuperação

Ao analisar o isolado, se a pureza, a recuperação ou a atividade não corresponderem ao esperado, avalie o isolado para verificar as seguintes situações:

• Ao testar diretamente do recipiente de coleta, gradientes de concentração podem se formar. Como resultado, o resultado de pureza depende de onde a amostra é retirada no recipiente de coleta. As amostras devem ser bem misturadas antes da análise para obter um resultado representativo.
• Se a amostra for mais solúvel em um solvente forte, como o DMSO (Dimetilsulfóxido, Dimethyl sulfoxide), mas não na fase móvel, a fração coletada se cristalizará à medida que for armazenada no recipiente de coleta, com o passar do tempo. Se a fase líquida for extraída para análise de pureza e concentração, os resultados serão representativos apenas da porção solúvel.
• O composto ativo também pode ser perdido devido à decomposição entre o momento da coleta, o teste de pureza e o teste de atividade. Ele também pode se decompor durante o processo de secagem. Portanto, o teste de atividade quase sempre é realizado antes e depois da secagem.
• O composto ativo foi retido na coluna.
• O composto ativo é instável nas condições utilizadas no processo de isolamento.
• A solução de extrato pode não ter sido preparada em um solvente compatível com a fase móvel; portanto, pode ter ocorrido precipitação.
• A maior parte do composto ativo está espalhada por uma ampla variedade de frações, resultando em quantidades indetectáveis do composto presente nas frações.
• A atividade do extrato pode estar relacionada à presença de outros compostos na amostra bruta, sem que ele esteja ativo individualmente.
• O isolado talvez não seja tão puro quanto esperado se tiver sido coletado em um comprimento de onda UV onde as impurezas perto da eluição não foram absorvidas.

Se o isolado não estiver dentro dos requisitos de pureza, rendimento ou recuperação da aplicação, uma repurificação do isolado poderá ser realizada utilizando o mesmo método de separação — ou um novo método de separação geral poderá ser desenvolvido com uma seletividade de coluna diferente. Cabe ao cientista determinar o tempo e o esforço que deseja investir para que a purificação atenda aos objetivos de pureza, rendimento e recuperação desejados.