Primer sobre cromatografia líquida preparativa

Quando há uma demonstração inicial do valor potencial de um isolado, é possível fazer um "aumento de escala" do método de separação para gerar quantidades crescentes desse isolado para avaliação posterior. Os atributos de separação em pequena escala, como resolução, podem ser facilmente mantidos em grande escala. A taxa de fluxo, a carga de amostra e o hardware do sistema devem ser modificados para transferir efetivamente a separação para colunas de maior capacidade por meio de fórmulas matemáticas definidas.

Geralmente, o primeiro estágio do aumento de escala abrangerá a produção de quantidades, de mg para grama, do isolado para várias utilizações, que vão desde a avaliação biológica inicial até o estabelecimento de relações estrutura-atividade para produtos análogos com propriedades terapêuticas melhoradas. Os estágios adicionais do aumento de escala envolvem quantidades de material de 100 g a vários quilos ou mais para o desenvolvimento pré-clínico e clínico, que, se bem-sucedido, culminará na fabricação em escala total. Nessa escala, a documentação e os controles de qualidade, como as Boas práticas de fabricação (cGMP, Good Manufacturing Practices), entram em cena.

A rotina de trabalho de aumento de escala é um processo em etapas. Os cálculos de aumento de escala devem ser realizados com precisão, ou o resultado final pode não fornecer a resolução alcançada na separação em pequena escala. Para aumentar o sucesso do escalonamento do método e manter o tempo de retenção e a seletividade, vários requisitos precisam ser considerados atentamente:

• Uma fase móvel idêntica deve ser utilizada em pequena e grande escalas.
• Colunas com recheio de coluna, comprimento e tamanho de partícula idênticos fornecem um aumento de escala mais fácil. Como alternativa, o tamanho da partícula pode ser alterado desde que a razão entre o comprimento da coluna e o tamanho da partícula (L/dp) do método inicial seja mantida.
• As amostras precisam ser preparadas na mesma concentração, no mesmo diluente.

Determinação do volume morto

O volume morto (atraso de volume, volume do sistema) é importante para preservar a resolução de pico dos picos de eluição iniciais ao aumentar a escala ou alterar os sistemas. Ele é definido como o volume do ponto de formação do gradiente até o cabeçote da coluna. Para sistemas LC de mistura de alta pressão, esse volume compreende principalmente o misturador, a tubulação de conexão e o loop do amostrador automático. Os sistemas de mistura de baixa pressão combinam os solventes a montante da bomba, de modo que a tubulação adicional somada ao volume do cabeçote da bomba (ou cabeçotes) e ao misturador, a tubulação de conexão e o loop do amostrador automático contribuem para o volume morto geral.

Quando os componentes da fase móvel são misturados on-line para separações isocráticas, o volume morto ainda existe — porém, como a concentração da fase móvel é constante, não há diferença observável na cromatografia. Os métodos de gradiente, por outro lado, dependem de uma mudança na concentração da fase móvel ao longo do tempo para gerar a separação de pico. A compensação para o volume morto em um método de gradiente garante que os tempos de retenção de pico sejam mantidos, o que é especialmente importante quando a intenção é coletar frações purificadas.

Para determinar o volume morto, um gradiente por etapas de fase móvel A e os solventes de fase móvel B contendo um aditivo com absorção de UV diferente (por exemplo, 0,05 mg/mL de uracila ou 0,2% de acetona em acetonitrila) podem ser utilizados de acordo com o método encontrado na "Calculadora de gradiente analítico a preparativo", disponível em www.waters.com/prepcalculator.

Capacidade

Na cromatografia de purificação, o foco principal é manter a resolução adequada para o composto-alvo da coleta. A capacidade da coluna, ou carga, é medida pela resolução do composto e picos adjacentes. Embora a capacidade da coluna seja influenciada principalmente pelo comprimento e pelo diâmetro dela, outros fatores, como a solubilidade, e a complexidade da mistura de amostra, podem contribuir. Veja a seguir as tendências de capacidade:

• A capacidade depende principalmente da solubilidade da amostra específica.
• A capacidade é maior para misturas simples.
• A capacidade é menor onde é necessária uma resolução alta.
• A capacidade depende das condições de carregamento.

A capacidade para um composto de interesse específico é determinada antes do aumento de escala do método por meio de estudos de carregamento. Esses estudos são realizados em pequena escala e executados por uma das seguintes técnicas: uma amostra é preparada em uma concentração alta e o volume de injeção é aumentado gradativamente; ou uma amostra é preparada em várias concentrações e o volume de injeção é mantido constante. Para qualquer uma das técnicas, o objetivo é determinar a concentração ou o volume de injeção máximos que mantém a resolução adequada do composto de interesse em relação às impurezas ao redor. Quando a capacidade da coluna é determinada, ela pode ser ampliada utilizando uma fórmula para colunas de diâmetro maiores e rotinas de trabalho.

Equação 10: aumento de escala da carga de concentração

Portanto, para aumentar a escala de uma carga de 1800 µg (1,8 mg) em uma coluna analítica de 4,6 mm x 50 mm para a carga equivalente de 19 mm x 50 mm em uma coluna preparativa:

Equação 11: aumento de escala do volume de injeção

Para aumentar a escala de uma carga de volume de injeção de 20 µL:

Diluição na coluna

Solventes fortes, como o DMSO (Dimetilsulfóxido, Dimethyl sulfoxide), podem melhorar a solubilidade da amostra, resultando em um aumento potencial na capacidade da coluna. Infelizmente, grandes volumes de injeção de solventes fortes podem distorcer a cromatografia, resultando em uma redução, em vez de um aumento, na quantidade de produto que pode ser isolado com êxito.

A distorção ocorre quando um solvente forte é transportado do injetor para o cabeçote da coluna como um volume da amostra imprensado em um fluxo de solvente aquoso. A precipitação da amostra pode ocorrer nas bordas do volume da amostra onde o solvente forte da amostra é diluído com o solvente aquoso. Essa precipitação pode resultar em um bloqueio no caminho do fluido e levar ao desligamento do sistema por alta pressão.

Se a precipitação não causar o desligamento do sistema, a amostra entrará na coluna, mas não haverá retenção até que o volume da amostra seja diluído com a fase móvel. Com injeções maiores, o volume necessário para diluir a amostra só pode ser obtido movendo o volume da amostra uma distância significativa ao longo da coluna. Nesses casos, a amostra é depositada como uma faixa larga que ocupa uma grande fração do volume da coluna. O resultado é uma resolução de pico incompleta de picos espalhados por grandes volumes de eluente. É possível reduzir essa situação limitando estritamente o volume e a massa da amostra injetada.

A alternativa é a diluição substancial da amostra com água, ou solvente fraco, para garantir uma retenção adequada.

Nenhuma das abordagens é totalmente satisfatória, pois há comprometimento do rendimento e da recuperação. Como alternativa, em um sistema de diluição na coluna, o sistema é reconfigurado para que o volume da amostra seja carregado até a entrada da coluna, onde é continuamente diluído com um fluxo de diluente aquoso. A taxa de transferência para a coluna é tão alta que a precipitação não pode ocorrer. As moléculas da amostra são, então, adsorvidas pelo material de retenção como bandas muito estreitas que podem ser eluídas como picos de pequeno volume e bem resolvidos. A robustez do sistema é aprimorada com a diluição na coluna, pois a amostra tem capacidade limitada de precipitar no loop ou no cabeçote da coluna.

A resolução melhorada entre os picos dos componentes da amostra permite aumentar o tamanho da amostra e, assim, reduzir o número de injeções necessárias para o isolamento. Na prática, com a diluição na coluna, o carregamento da coluna pode frequentemente ser aumentado de três a cinco vezes. A incidência de desligamentos por alta pressão é reduzida, e a vida útil da coluna é estendida.

Aumento de escala da taxa de fluxo

Para manter com sucesso a qualidade de separação durante o aumento de escala, a velocidade linear deve permanecer constante entre as colunas pequenas e grandes. Portanto, o escalonamento da taxa de fluxo funciona melhor entre colunas grandes e pequenas com o mesmo comprimento, tamanho de partícula e material de retenção. As capacidades do hardware do sistema, como o fluxo máximo da bomba e os limites de contrapressão, devem ser consideradas ao escalonar a taxa de fluxo. Se o hardware não atender aos requisitos de taxa de fluxo, faça as alterações apropriadas nos equipamentos para atender à escala.

Equação 12: aumento de escala da taxa de fluxo

Por exemplo, se a taxa de fluxo de uma coluna analítica (5 µm, 4,6 mm x 50 mm) for de 1,5 mL/min, a taxa de fluxo em uma coluna preparativa (5 µm, 19 mm x 50 mm) será calculada.

Aumento de escala da duração do gradiente

Normalmente, nenhuma alteração de gradiente será necessária durante o aumento de escala se a taxa de fluxo for ajustada para manter a velocidade linear da fase móvel. Se os comprimentos da coluna forem diferentes, o tempo de gradiente deverá ser calculado para manter o tempo de separação e de retenção obtido em pequena escala.

Equação 13: aumento de escala do tempo de gradiente

Por exemplo, um segmento de gradiente linear com duração de 5 minutos em uma coluna analítica de 50 mm levará 10 minutos em uma coluna preparativa de 100 mm.

Calculadora para Escala Preparativa

Os cálculos para o aumento da escala de massa, fluxo e gradiente também podem ser realizados na Calculadora de colunas preparativas OBD. A calculadora é um aplicativo fácil de utilizar que ajuda em todos os cálculos de escalonamento analítico para preparativo, incluindo carga de massa, volume do sistema, taxas de fluxo, consumo de volume de solvente, razões de fluxo de separação para cromatografia acoplada a espectrômetro de massas e métodos de UPLC de gradiente focado para transferência de método preparativo. O aplicativo pode ser acessado em www.waters.com/prepcalculator ou por meio de um software de purificação da Waters, como o ChromScope.