Primer sobre cromatografia líquida preparativa

Quando uma separação isocrática ou um gradiente focado não separam adequadamente o composto de interesse, a separação pode ser desenvolvida novamente por meio de alterações no solvente, no pH, na fase estacionária e/ou na temperatura. Esses tipos de modificações podem ter um impacto significativo na separação. Por isso, é preciso realizar gradientes de verificação seguidos pela otimização do método após qualquer uma dessas alterações.

Solvente

A fase móvel de HPLC é composta por três componentes; solvente fraco, solvente forte e modificador. Os solventes devem ser de alta pureza, compatíveis com o detector, não reativos com a amostra e ter baixa viscosidade para manter a contrapressão do sistema baixa.

Na cromatografia de fase reversa, o solvente fraco é quase sempre água, enquanto a acetonitrila e/ou metanol são comumente utilizados como o solvente forte devido à baixa viscosidade, à alta resistência e à favorabilidade de UV (Ultravioleta) no intervalo de comprimento de onda baixo. A acetonitrila e o metanol também fornecem o melhor formato de pico, evaporam facilmente após o isolamento e tendem a não reagir com a maioria das amostras.

Como acontece com qualquer solvente utilizado para separação cromatográfica, é importante permanecer acima do limite de UV relatado do solvente durante a análise da amostra. Abaixo desse valor, as alterações na composição do solvente são registradas pelo detector como deslocamento da linha de base ou outros distúrbios cromatográficos.

A separação e a ordem dos picos podem ser diferentes dependendo do solvente forte utilizado para a separação. É difícil prever qual solvente fornecerá a resolução mais alta para o composto de interesse. Portanto, a escolha de um solvente forte é, em geral, determinada por tentativa e erro. Opcionalmente, solventes fortes podem ser misturados (por exemplo, acetonitrila/metanol na proporção de 50:50) para atingir uma ordem de eluição ou resolução desejada.

pH

O pH da fase móvel é uma variável muito importante no controle de retenção para separações de fase reversa. Geralmente, os compostos contêm um ou mais grupos funcionais ácidos ou básicos; por isso, a maioria das fases móveis de fase reversa requer o controle do pH.

Quando um ácido está mais de 2 unidades de pH acima ou abaixo de seu pK_a, ele será > 99% ionizado ou não ionizado, respectivamente. Em contraste, as bases são ionizadas abaixo de seu pK_a e não ionizadas acima de seu pK_a. A forma não ionizada será menos polar (mais hidrofóbica) e, portanto, mais fortemente retida em um sistema de fase reversa. Como resultado, a retenção de ácidos é melhor em pH baixo, enquanto a retenção de bases é melhor em pH alto.

Se o pH da fase móvel estiver próximo do pK_a do composto de interesse, pequenas alterações no pH podem causar grandes mudanças na retenção, o que pode afetar diretamente a robustez da separação. O pH da fase móvel é controlado pela adição de um tampão. O tampão mantém o pH quando uma pequena quantidade de ácido ou base é adicionada. Ele é mais eficaz quando utilizado dentro de ±1 unidade de pH em relação ao pK_a, mas pode fornecer um tampão adequado com uma variação de ± 2 unidades de pH em relação ao pK_a.

Ao selecionar um pH de trabalho, a estabilidade da coluna também deve ser considerada.

As colunas à base de sílica funcionam melhor entre pH 2 e pH 8. Uma fase ligada é suscetível à hidrólise em pH baixo; já em pH alto, a estrutura da sílica torna-se cada vez mais solúvel. Em pHs acima de 8, é necessária uma partícula não baseada em sílica ou uma partícula com um ligante projetado especificamente para estabilidade em pH alto. Os limites de pH e as recomendações gerais de manuseio podem ser encontrados no folheto informativo da coluna ou no site do fabricante da coluna.

Quando um método cromatográfico se destina à utilização para fins de purificação, os aditivos tampão utilizados para ajustar o pH devem ser adequadamente voláteis para facilitar a remoção do isolado purificado. Além disso, ao utilizar aditivos voláteis, deve-se tomar cuidado para evitar contaminação ou precipitação na fonte de MS (Espectrometria de Massas, Mass Spectrometry). Aditivos comuns, como ácido fórmico, ácido acético e acetato de amônio, funcionam melhor a uma concentração de 0,05 a 0,1% quando dissolvidos na fase móvel. O fosfato, o aditivo tampão mais popular para separações cromatográficas líquidas, não é recomendado para aplicações de MS ou purificações.

Recomenda-se uma concentração de tampão entre 5 e 10 mM. Ao utilizar tampões, é importante filtrar o tampão após o preparo e lavar as linhas da bomba quando não estiverem sendo utilizadas para evitar precipitação em linha. Além disso, substitua as soluções regularmente para evitar o acúmulo de crescimento biológico.

Fase estacionária

A fase estacionária da coluna tem um impacto significativo na separação. As fases estacionárias da fase reversa variam de C₁₈ a C₈ ou podem conter ligantes projetados para promover a seletividade e o poder de separação. Como muitos laboratórios têm um estoque de colunas limitado, a substituição da fase estacionária é, com frequência, um último recurso quando o solvente e o pH não fornecem uma resolução adequada. O Gráfico de seletividade de coluna de fase reversa da Waters (www.waters.com) fornece uma comparação da seletividade entre diferentes fabricantes de colunas de fase estacionária. Essa ferramenta é muito útil no desenvolvimento inicial de métodos para comparar a seletividade da coluna.

Comprimento

O comprimento da coluna é um fator no desempenho da separação. As colunas podem ser adquiridas em vários comprimentos, incluindo 25 mm, 50 mm, 100 mm, 150 mm e 250 mm.

As colunas mais curtas têm contagens de placas mais baixas, mas são boas para separações rápidas. Já as colunas mais longas têm contagens de placas mais altas e resultam em tempos de retenção mais longos. Com um comprimento maior, a contrapressão, o tempo de corrida, o consumo de solvente e o custo aumentam proporcionalmente. Consequentemente, a opção ideal é a coluna mais curta que forneça uma resolução adequada.

Tamanho de partícula

A capacidade da coluna de resistir à dispersão ou à expansão de uma banda da amostra conforme ela passa através do leito preenchido é chamada de "eficiência". Tamanhos de partícula menores aumentam a eficiência porque a dispersão de pico é menor dentro das partículas. Uma eficiência alta resulta em larguras de pico estreitas e melhor poder de separação.

Normalmente, os tamanhos de partículas de colunas preparativas variam de 5 a 10 µm, enquanto as separações analíticas de altíssima pressão utilizam tamanhos de partícula de 1,7 a 3,5 µm. Embora tamanhos de partícula muito pequenos forneçam uma eficiência maior, a desvantagem é um aumento no custo da coluna e na contrapressão do sistema. As colunas preparativas em grande escala, que são executadas em taxas de fluxo altas com misturas de amostras brutas, muitas vezes não são oferecidas em tamanhos de partícula muito pequenos por esses motivos.

Temperatura

Como temperaturas distintas podem impactar a seletividade, o aquecimento da coluna é uma ferramenta conveniente para otimizar a separação de uma amostra específica. A viscosidade da fase móvel e a pressão total do sistema são reduzidas com uma temperatura elevada, o que resulta em menos tensão no sistema, nas conexões e na coluna — aumentando, por fim, a robustez da operação. A temperatura também pode diminuir os tempos de retenção e alterar a seletividade da separação. É difícil prever se as mudanças de temperatura aumentarão ou diminuirão a resolução de pico. Portanto, a utilidade é específica para cada separação em particular.

Embora o controle da temperatura na cromatografia em pequena escala seja de rotina, a temperatura raramente é empregada como um parâmetro para manipular a cromatografia voltada a purificação em escala preparativa. Primeiro, as colunas de grande diâmetro podem ser difíceis de aquecer uniformemente a partir do lado externo. Em segundo lugar, as separações com taxa de fluxo alta utilizadas em grande escala tendem a permanecer na temperatura do solvente que entra. Mantas elétricas e fornos de coluna, embora sejam satisfatórios para separações em pequena escala, não conseguem aquecer uniformemente todo o diâmetro de uma coluna grande. Como resultado, gradientes de temperatura se formam ao longo do diâmetro da coluna, afetando negativamente a cromatografia.

Se o controle da temperatura for necessário para manter a solubilidade da amostra, é possível superar os gradientes de temperatura colocando a coluna preparativa em um banho de água aquecida, com uma tubulação conectada no cabeçote da coluna. Essa tubulação atua como um preaquecedor para equilibrar, na temperatura desejada, o solvente que entra. O desenvolvimento de cromatografia destinada a um futuro aumento de escala é melhor quando o controle das condições ambientais e da temperatura é utilizado como último recurso.