質譜分析入門讀本

電子游離(EI)

許多人對電子游離(EI)並不陌生。（有時會使用早期術語「電子撞擊」，不過技術上來說是不正確的）。進行EI的方式通常是讓樣品接觸到70 eV的電子，這種方式被稱為一種「硬」游離技術。與相關分子產生交互作用之電子的能量，通常遠大於分子內鍵結的能量，因此會發生游離作用。多餘能量會以已經充分表徵的方式打破鍵結，產生可以預測且能鑑別的碎片，讓我們依此推算出分子的身分。若只從外電子層抽取出一個電子，會產生一個正離子模式(M.+)的自由基陽離子以及豐富的碎片譜圖。EI技術不同於某些「更軟」的大氣壓游離技術，這些技術產生的譜圖訊號值有時取決於製造商特定的離子源設計，而EI技術則完全不受離子源設計影響。使用兩台EI儀器分析相同化合物所產生的譜圖雷同，有助於建立譜圖資料庫，用於比對不明物譜圖與參比譜圖。

化學游離(CI)

為免分子嚴重碎斷，需要採用「軟」游離技術。化學游離(CI)透過較溫和的質子轉移過程產生離子，這樣能夠保留及輔助出現分子離子。樣品會接觸到過量的試劑氣體，例如當甲烷形成質子化分子離子(M + H)時產生的試劑氣體。相反的過程會產生負離子。在某些情況下，將質子轉移到氣體分子中可以產生負離子(M-H)。

化學游離(CI)有時用於化學性質與EI適用之分析物類似的化合物，能夠改善嚴重碎斷的分子離子的豐度或外觀。與EI類似，樣品必須保持熱穩定，因為在源中加熱會導致樣品汽化。CI的游離機制需靠EI進行一開始的游離步驟，但CI的源內是高壓下的化學試劑氣體，例如甲烷、異丁烷或氨。濃度遠高於分析物的試劑氣體(R)以電子游離方式完成游離後得到初級R+試劑離子。R+離子與中性R分子碰撞會形成穩定的次級離子，這些離子是反應物種，之後以離子分子反應進行分析物分子(A)游離作用。

例如，甲烷離子和甲烷分子之間的離子-分子反應會產生相當穩定的CH₅⁺離子。

CH₄^+. + CH₄  --> CH₅⁺ + CH₃^.

反應離子CH₅⁺可以通過質子轉移、奪氫反應或電荷交換游離中性分析物分子(A)。

RH⁺ + A --> R + AH⁺（質子轉移）

(R-H)⁺ + A --> R + (A-H)⁺（奪氫反應）

R+^. + A --> R + A^+.（電荷交換）

最常見的游離反應是質子化，質子親和力高於試劑氣體的分子容易發生這種游離。奪氫反應常見於質子親和力低的分子，而電荷交換容易在游離能高的試劑氣體中發生。

待分析物質的壓力遠低於試劑氣體。如將甲烷視為試劑氣體，電子撞擊主要會導致甲烷游離，部分碎斷成CH₃⁺。這些離子隨後在源內所採用的高壓下會出現離子-分子反應。

CH₄^+. + CH₄  --> CH₅⁺ + CH₃^.

CH₃⁺ + CH₄  --> C₂H₅⁺ + H₂

CH₅⁺充當布氏酸，C₂H₅⁺充當路易斯酸，讓分析物產生離子。

慎選CI試劑氣體能改善目標物是分析物分子的電荷轉移，因為化學游離氣體的氣相酸度會影響電荷轉移的效率。在CI中，分析物更有可能產生碎斷較少的分子離子，從而節省了通常在EI中內化以利破壞鍵結的能量。

負離子化學游離(NCI)

對於含有電子捕獲部分（如氟原子或硝基苄基）的分析物，可以採用CI的變化版：負離子化學游離(NCI)。這項技術的靈敏度可以比EI高出許多倍（據報在某些情況下能高出100-1000倍）。NCI適用於多種小分子，這些小分子會（或可以）被化學修飾，用於促進電子捕獲。

在負離子化學游離中，產生負離子的主要機制分為兩種：電子捕獲和反應離子化學游離。在CI條件下，負電分子可以捕獲熱電子，用於產生負離子。負離子化學游離的機制是分析物化合物(AH)與帶負電荷的反應離子(R^-.或R^-）反應。這一過程可能發生數種離子-分子反應，最常見的是去質子反應。

AH + R^-  --> A^- + RH

反應離子的質子親和力（鹼度）越高，發生去質子反應的可能性越大。

氣相層析(GC)

許多人第一次接觸到的質譜儀可能是氣相層析中使用的偵測器。GC-MS儀器類型的範圍已經擴大，遠遠超越早期儀器設計的侷限，或是為了因應環境分析、食品安全篩查、代謝組學應用以及法醫鑑定、毒理學和藥物篩查等臨床應用方面日益嚴格的法規要求。

過去，GC-MS分析主要使用兩種類型的質譜儀：扇形磁場和單四極桿儀器。前者的解析度高，可提供準確質量分析，適合用於需要極高靈敏度的應用。後者適用於目標化合物的例行分析。

難度最高的GC-MS分析採用扇形磁場儀器：環境/工業樣品中的戴奧辛分析，或是篩檢在體育比賽中為提高成績而非法使用的藥物。扇形磁場儀器很容易做到高解析度/選擇性的飛克偵測水準。

四極桿GC-MS系統推出後不久，就在目標分析應用中得到認可。美國環保局的方法要求必須使用四極桿GC-MS儀器分析樣品中的多種環境污染物。由於這些應用只需要皮克到納克級的偵測水平，因此四極桿儀器的靈敏度比扇形磁場儀器差並不會造成限制。相對而言，四極桿儀器能大大降低成本、使用起來更簡便，而且方便攜帶，更加證明這種方式是上上之選。

液相層析(LC)

這項創新技術讓我們得以分析約80%無法靠GC做到的化學分析，這也是近數十年來質譜技術蓬勃發展並受到更多關注的原因。LC與MS的結合特別受某幾位人士的影響（請見「簡史」一節）。我們今天所熟知的LCMS大約從1970年代開始發展，到1990年代初開始進入成熟階段。如今我們在實務上所用的許多裝置和技術都是直接承襲自那個時代。

液相層析的定義最早在1990年代由俄羅斯植物學家Mikhail S. Tswett在發表的研究中提出。他的研究重點是在一支填充有顆粒的管柱中使用溶劑分離從植物葉片中萃取的色素。形式最簡單的液相層析，必須要有能力以極高的精密度預測和再現溶液（移動相或冷凝相）中分析物通過顆粒填充床（固定相）時彼此之間的相互競爭作用。近年來開發出填充有多種官能基的管柱，加上能夠精準輸送移動相的溶劑輸送系統，使得LC成為許多產業的分析骨幹。

HPLC這個縮寫是Csaba Horváth在1970年創造的，表示這項技術需要以高壓使充填管柱中產生液相層析分離所需的流量。此後HPLC的效能不斷進步，包括開發出更小的顆粒和更廣泛的選擇性，而縮寫的意義也改成了高效能液相層析(high-performance liquid chromatography)。

2004年，儀器和管柱技術更進一步發展，顯著提高了液相層析的解析度、速度和靈敏度。一項管柱顆粒更小[1.7微米]且儀器構造專為在15,000 psi [1,000 bar]之下輸送移動相而設計的技術問世，稱為UPLC技術，這個不同的術語代表極致效能液相層析(ultra-performance liquid chromatography)。這種當代技術所實現的內容，大多都符合John Knox等研究人員在80年代所做的預測。Knox預測最佳粒徑會是1-2 μm，並且層析分離非常容易受摩擦熱溫度變化的影響。要開發能夠廣泛運用的UPLC，所需具備的技術要能開發並解析堅固、均勻的小顆粒。瀏覽探討HPLC和UPLC的優質基本入門讀本。

電噴灑(ESI)

通用術語「大氣壓游離」(API)包含電噴霧游離(ESI)這項最著名的技術，這項技術能夠在大氣壓而不是真空條件下產生離子，是各種相關技術的基礎。將樣品溶解在極性溶劑中（通常揮發性比GC所用溶劑的揮發性更小），再由電壓介於2000-4000 V之間的不鏽鋼毛細管抽送。液體離開毛細管時，會在大氣壓力下霧化，在靜電吸引和真空的綜合作用下，從去溶劑化液滴脫落的離子流入質譜儀。

電位從液體轉移到分析物從而產生離子的機制仍然是一個具有爭議性的話題。1968年，Malcolm Dole首次提出了電荷殘留機制，他假設當液滴蒸發時，其電荷保持不變。液滴的表面張力最終無法抵抗所施加的電荷產生的排斥力，因此會爆裂成許多更小的液滴。這些庫倫裂變會持續發生，直到液滴內只有單個分析物離子。當最終液滴所含的溶劑蒸發後，就形成氣相離子。

1976年，Iribarne和Thomson提出了另一種模型，就是離子蒸發機制，其中小液滴會經由庫倫裂變形成，與Dole模型中的形成方式類似。然而，根據離子蒸發理論，液滴表面的電場強度足夠高，這種能量優勢會使溶劑化離子傾向於離開液滴表面並直接轉移到氣相中。

事實上，這兩種機制或許能夠發揮協同作用：電荷殘留機制主要用在質量高於3000 Da的情形，而離子蒸發則主要用於質量較低的情形（請見R Cole, Some tenets pertaining to Electrospray ionization mass spectrometry, J of Mass Spec, 35, 763–772 (2000)）。

液相層析分離所產生的液體會以電荷平衡狀態進入ESI探針。因此，當溶劑離開ESI探針時會帶凈離子電荷。為確保ESI是一項連續技術，溶液必須藉由電化學反應而帶電，在過程中會將電子轉移至充當電極的導電表面上。除了其他效應之外，這個過程也有可能會導致pH值變化。假設在正離子模式下，帶正電荷的液滴離開噴霧，而電極則會接受電子（氧化）。（在負離子模式下，情況正好反過來。）電活性電極的表面積、電流大小、化學物質的性質及其電極電位都會引發效應。

整體而言，ESI是一項高效率的技術。然而，各種物質的反應活化能和能量差整體而言是不同的。溶液的流速和施加的電流決定每個液滴的極限。分子之間發生競爭並抑制相關分析物的現象並不罕見。

事實證明，基本ESI理論的延伸是有效的（例如將液體減少到極低的體積），以nanospray技術為例，它可以將液流降至30 nL/min，這對於樣品量有限的蛋白質和胺基酸研究尤其有用。

大氣壓化學游離(APCI)

雖然有關APCI的研究與ESI相關研究時同時期發表的，但直到1985年ESI因為Fenn的研究成果得到商業化之後，人們才廣泛採用APCI。

Horning於1973年首次將APCI與各種樣品引入技術相結合，用於分析揮發性化合物，其中之一就是HPLC。APCI具輔助功能，可以接受那些難以被ESI轉換成氣相離子的分析物，將極性較弱且揮發性較高的分析物從冷凝相或液流引入質譜儀中。APCI不同於ESI，它是在加熱氣流中蒸發引入的液體，將中性分析物轉移到氣相中。化學游離必須仰賴帶電物質在試劑離子和目標分子之間的轉移來產生可以進行質量分析的目標離子。最常見的情況是，在正離子模式下，目標分子和較小的H⁺離子形成加成物，不過目標分子也經常與鹽形成加成物。例如，若移動相中存在弱酸弱鹼鹽乙酸銨，就有可能形成銨加成物(M+NH₄)⁺，這是一種改性劑，通常用於代替揮發性較低且高度離子化的磷酸鹽緩衝液。在鹽濃度較高的情況下，質子化和氨化離子之間的競爭可能會降低兩者的訊號值。在APCI中能夠形成的最大離子數比在ESI中大得多，這是因為會形成多餘的試劑離子。液體在推動之下通過一個非導電管，這通常是週圍有霧化氣體流動的熔融石英玻璃管。由此產生的細小液滴與延伸出這根非導電管末端以外的管子（或探針）的加熱內壁碰撞，從而轉化為氣相。這種游離類型的線性速度通常比與電噴霧相關的HPLC或極致效能液相層析(UPLC)流速大得多。然而，當代儀器能發揮更大的去溶劑化能力，也讓所有需依賴氣溶膠的技術得以發揮更高的效能。

之後會透過化學游離作用游離去溶劑化的分析物分子。游離電位不再像ESI一樣經由液體施加，而是在針尖位置以電漿或電暈放電方式施加，液滴將從中通過。實際上，移動相會發揮中介作用，將電荷轉移至分析物。因此，APCI早期的名稱是「溶劑介導的電噴灑」。