液相層析初學者指南

什麼是HPLC（高效能液相層析）？

歷史簡介和部分定義

液相層析(LC)是1900年代初期由俄羅斯植物學家Mikhail S. Tswett定義的名詞。他的開創性研究著重於分離化合物[葉色素]，在一支填充有顆粒的管柱中使用溶劑從植物中萃取。

Tswett使用顆粒填充了一支開放式玻璃管柱。他發現兩種很有用的特殊材料，分別是白堊[碳酸鈣]和氧化鋁。他將樣品[均質植物葉片的溶劑萃取物]倒入管柱中，使其通過顆粒層床。接著倒入純溶劑。當樣品由重力作用往下通過管柱時，可以看到不同顏色的譜帶分離出來，因為某些成分的移動速度比其他成分快。他將這些分離出的不同顏色的譜帶與樣品中原本含有的不同化合物關聯，並根據每種化合物對顆粒的不同化學吸引力強度，建立了這些化合物的分析分離方法。被顆粒較強烈吸引的化合物移動速度減慢，而被溶劑較強烈吸引的其他化合物則移動得更快。這個過程可描述如下：樣品中所含的化合物在移動溶劑（稱為移動相）和顆粒（稱為固定相）之間以不同方式分布或分配。因此，每種化合物以不同的速度移動，使化合物得到分離。

Tswett以層析分離(chromatography)（源自希臘字chroma和graph，前者意指顏色，後者意指書寫，字面意思就是顏色書寫）來命名這個過程，說明這項實驗多麼繽紛多彩。[奇妙的是，這位俄羅斯人的名字Tswett也是color—顏色的意思。]如今液相層析已經發展成各種形式，成為分析化學中最強大的工具之一。

圖A：Tswett的實驗

液相層析(LC)技術

液相層析可以使用平面[技術1和2]或管柱技術[技術3]進行。管柱液相層析功能最強大，樣品容量最大。無論使用何種技術，都要先將樣品溶解在液體中，然後再輸送到層析分離裝置上或之中。

技術1.樣品點上玻璃平板並且流過表面後，會留有一層薄薄的層析分離顆粒[固定相] [圖B]。平板底部邊緣置於溶劑中。當溶劑[移動相]擴散到乾顆粒層並沿玻璃平板向上移動時，就會因毛細作用而產生流動。這種技術稱為薄層層析或簡稱TLC。

請注意，黑色樣品是經過層析分離的FD&C黃色、紅色和藍色食用色素的混合物。

圖B：薄層層析

技術2.在圖C中，樣品點到濾紙[固定相]上。然後將溶劑[移動相]加到點的中心，產生向外的徑向流動。這種方式稱為紙層析。[典型紙層析的執行方式類似於線性流動的TLC。]在上圖中，將相同的黑色FD&C色素樣品塗在濾紙上。

注意這張特定濾紙的分離能力比起TLC平板有何差異。綠環表示濾紙無法分離出黃色和藍色染料，但能分離出紅色染料。最下方圖片中，將同樣黃色和藍色染料組成的綠色樣品塗在濾紙上。不出所料，濾紙無法分離這兩種染料。在中間圖片中，將紅色和藍色染料組成的紫色樣品塗在濾紙上。隨即便能分離開來。

圖C：紙層析

技術3.以這種最有效的方法，樣品通過含有適當顆粒[固定相]的管柱或萃取匣裝置。這些顆粒稱為層析填充材料。溶劑[移動相]流過裝置。在固相萃取[SPE]中，樣品裝入萃取匣上，溶劑流會攜帶樣品流過裝置。與Tswett的實驗一樣，樣品中的化合物會以不同的速度流過裝置而分離出來。本例將黑色樣品裝入萃取匣上。每個步驟使用不同的溶劑來分離樣品。

使用萃取匣時，有幾種方法可以使溶劑流動。對於無法承受壓力的管柱，可以使用重力或真空作用。通常，這種情況下的顆粒直徑較大[>50微米]，因此流動阻力較小。例如開放式玻璃管柱[Tswett的實驗]。此外，一般為注射筒形狀的小型塑料管柱也可以裝入填充材料顆粒，用於樣品前處理。這稱為固相萃取[SPE]。在本例中，層析分離裝置（稱為萃取匣）通常採用真空輔助流動，以便在進一步分析非常複雜的樣品之前先將其淨化乾淨。

這種方法需要更小的粒徑[<10微米]來提高分離能力。但是，顆粒越小，流動阻力就越大，因此需要更高的壓力來產生所需的溶劑流速，於是就需要能承受高壓的幫浦和管柱。當溶劑在中高壓之下流過層析分離管柱時，這項技術稱為HPLC。

圖D-1：管柱層析分離 – 固相萃取[SPE]

什麼是高效能液相層析(HPLC)？

HPLC縮寫是由已故教授Csaba Horváth於1970年的Pittcon論文中所創造的，最初是指使用高壓讓填充管柱產生液相層析所需的流動。一開始，幫浦的壓力值只有500 psi [35 bar]。此時稱為高壓液相層析(high pressure liquid chromatography)或簡稱HPLC。1970年代初期，這項技術開始飛躍進展。新的HPLC儀器可以產生高達6,000 psi [400 bar]的壓力，還能合併更進步的進樣器、偵測器和管柱。到了1970年代中後期，HPLC開始佔有一席之地。在此期間，儀器效能不斷進步[即使壓力再高，也可以使用更小的顆粒]，HPLC縮寫保持不變，但全名改為高效能液相層析(high performance liquid chromatography)。

高效能液相層析現在是分析化學中最強大的工具之一，它能分離、鑑定和定量任何可溶解於液體之樣品所含的化合物。如今，微量濃度低至兆分之一[ppt]的化合物也可以輕易鑑定出來。HPLC可以並且已經應用於幾乎任何樣品，例如藥物、食品、保健品、化妝品、環境基質、法醫毒物鑑證樣品和工業化學品。

什麼是極致效能液相層析（UPLC技術）？

2004年，儀器和管柱技術取得了一大進展，極大提高了液相層析的解析度、速度和靈敏度。管柱顆粒更小[1.7微米]，儀器有專項功能，可在15,000 psi [1,000 bar]壓力下輸送移動相，達到新的效能水平。為了執行極致效能液相層析(ultra-performance liquid chromatography)，現在稱為UPLC技術，就得全面打造一套全新系統。

今天，科學家們可以使用填充更小顆粒（直徑1微米）的管柱以及能夠在100,000 psi [6,800 bar]壓力下執行分析的儀器來開展基礎研究。讓我們更能一窺究竟，掌握未來。