質譜分析入門讀本

在質譜分析中，控制實驗的能力極為重要。在謹慎控制的條件下產生離子後，必須以適當的靈敏度將離子當成離散事件進行偵測。GC所製造的蒸汽量極少，因此早期成為理想的串聯技術選擇，但只適用於約20%的化合物。如今，我們最常將LC沖提液霧化，當成在質譜儀中引入分析物進行游離的方法，這是一種必須以真空環境妥善控制的技術。

抽氣能力是十分重要的質譜儀設計要素。真空必須均勻分佈在儀器的稀薄大氣區域中，並且必須足以抵銷諸如離子進樣端大小和需去除之蒸汽量等必要設計。

LC-MS抽氣能力需求取決於所用的介面。這是最終刺激API源開發的其中一個原因，因為API源能在蒸汽進入MS前就將其去除。

分析器是儀器分離或區分引進之離子的一種方式。離子源中會形成正離子和負離子（以及不帶電的中性離子物質）。不過，儀器在特定時間點只會記錄一種極性的離子。現代儀器可以在幾毫秒內切換極性，即使在快速瞬態事件也能產生可信度相當高的記錄，例如在典型訊號峰寬只有大約一秒的極致效能液相層析(UPLC)或GC分離中。

四極桿質譜儀

1953年，西德物理學家Wolfgang Paul和Helmut Steinwedel發表了他們開發四極桿質譜儀的研究成果。他們的研究發現，四個平行桿之間的疊加射頻(RF)和恆直流(DC)電位可以發揮質量分離器或過濾器的作用，分析器只能收集到在特定質量範圍內表現出恆定幅度振盪的離子。

現今儀器製造商將這些儀器的目標鎖定在具體應用。單四極桿質譜儀需要使用純淨的基質來避免不需要的離子造成干擾，這類質譜儀的靈敏度相當好。

三段四極桿或串聯式四極桿質譜儀(MS/MS)是單四極桿儀器多加一個四極桿製造而成，可以發揮多種不同的用途。其中一種用途是利用離子特有的質荷比(m/z)單純分離及偵測複雜混合物中的相關離子。這個多加的四極桿發揮作用的另一種方式是與受控的碎斷實驗結合使用。這類實驗需使相關離子與另一種分子（通常是氬氣等氣體分子）發生碰撞。在此類應用中，前驅物離子會碎斷成產物離子，MS/MS儀器即可依獨特的組成成分鑑定相關化合物。

四極桿分析器由四根桿組成，它們通常採平行排列方式，由鉬合金等金屬製成。開發四極桿設計的過程結合相當多的藝術和科學元素。施加直流(DC)和射頻(RF)場誘發儀器分析器中的離子運動，再以運動情況對不同質量的離子分類。若透過操作軟體的方式全面改變場強度，實際上會改變在任何一個指定時間點過濾或傳送到偵測器的m/z值。四極桿的解析度低於某些採用其他設計的質譜儀，如飛行時間(TOF)儀器。不過，四極桿相對簡單易用，是實用性相當高的儀器，能以相對低的成本提供各種不同的介面。

要比較及描述MS功能，必須掌握一些術語（本入門讀本的後段章節會有更完整的定義）：

解析能力

解析能力通常使用縮寫「res」，是指質譜儀分離兩種質量的能力：

• 低解析度=單位質量=1000
• 較高或中等解析度=1000~10,000
• 高解析度=10,000以上
• 超高解析度=高達3–5百萬
• 關於解析度的詳細說明以及量測方式，請見「質量準確度與解析度」一節。

精確質量是化合物質量的理論精確值，而準確質量是化合物質量的量測值，二者之間有一定誤差，如5 ppm。準確質量還常用於指涉技術，而非量測的質量。精確質量相關研究（例如在期刊上發表或申請專有技術）的普遍允收標準是能在儀器上測得理論質量5 ppm範圍內的量測值：對於250 Da，5 ppm相當於1.25 mDa（勿與5 mDa混淆，5 mDa對於250 Da來說相當於20 ppm）

MS/MS

描述各種多重反應監測(MRM)和單一反應監測(SRM)實驗。這是監測前驅物離子到產物離子轉換的過程，或稱碎斷過程，相較於單段儀器實驗，通常有利提高偵測的選擇性，專一性和/或靈敏度。在一台儀器中串聯使用兩台質量分析器或設置兩個質量分析階段。

三段四極桿質譜儀中共有三組四極桿過濾器，雖然只有第一組和第三組四極桿發揮質量分析器的作用。近年來的設計增加了更多功能，充分區分中間裝置（取代早期的四極桿設計），因此改用術語「三段四極桿」或「串聯式四極桿」。第一個四極桿(Q1)用作質量過濾器，負責將選定的離子加速傳輸到Q2，也就是碰撞室。雖然某些設計中的Q2類似於另外兩組四極桿，但Q2上施加的RF只用於傳輸離子，不用於選擇質量。Q2中的壓力較高，離子會與碰撞室中的中性氣體碰撞，導致離子會以碰撞誘發解離(CID)的方式碎斷。接下來，碎片加速進入Q3（另一個掃描質量過濾器），Q3將碎片分類後送入偵測器。

碰撞誘發解離(CID)亦稱為碰撞活化解離(CAD)，是一種分子離子在氣相中碎斷的機制，通常是在真空區域內以電位使分子加速，獲得高動能，然後與中性氣體分子（如氦氣、氮氣或氬氣）碰撞。一部分動能因為碰撞而轉換或內化，導致化學鍵結斷裂，分子離子碎成更小的碎片。一些類似的「特殊用途」碎斷方法包括電子轉移解離(ETD)、電子捕獲解離(ECD)。請見「生物分子游離法」一節。

左側進入的237 Da前驅物離子在MS/MS碰撞室中碎斷。數據系統可以只顯示相關碎片（不顯示產生的所有碎片），從而得到比全掃描MS譜圖更簡單的譜圖。您可以控制碎斷程度，就像可以選擇前驅物離子一樣。

逆相HPLC

「逆相」一詞描述與正相正好相反的層析模式，也就是使用極性移動相和非極性[疏水性]固定相。圖S-2示範了使用這種方法分離黑色的三染料混合物的結果。

在一些受監管的產業中，為符合陽性化合物鑑定規範，MRM轉換算1.5個「鑑定點」，SIR譜圖則算1.0個。因此，假設選擇性充足，要達到3個「IPS」，需要2個MRM轉換，或者3個SIR譜圖。

扇形磁場質量分析器又稱扇形場質量分析器，是一種早期的儀器設計，現今仍然存在，只不過數量不多（已被能在ESI游離模式下操作的現代ESI儀器取代）。例如，Waters AutoSpec就通用於靈敏度極高的戴奧辛分析。

扇形磁場會使離子運動軌跡呈弧形彎曲。離子的「動量-電荷」比決定軌跡的半徑，而軌跡本身則取決於電場和/或磁場。相較於m/z比較小的離子，離子的m/z比越大，需通過的路徑會越長。改變磁場強度可以控制路徑。雙聚焦質譜儀以各種組合將磁場和電場結合在一起，比較普遍的情況是扇形電場在前，磁場在後。這種最早期的混合方式採用扇形電場來增大離子在離開離子源時的動能，以利聚焦離子。在高能聚焦之後進行角聚焦，可以分離出整數質量相同但化學式不同的離子。

離子阱儀器的運作原理與四極桿儀器類似。然而，與過濾離子流的四極桿儀器不同，離子阱和功能更強大的離子迴旋加速(ICR)儀器會將離子存儲在三維空間中。在飽和之前，離子阱或迴旋加速器能夠根據離子質量噴射選定的離子進行偵測。可以在離子阱內進行一連串實驗，碎斷相關離子，運用碎片更進一步定義前軀物。施加到堆疊或「三明治」幾何結構（兩端設定端蓋電極）的RF電壓所產生的電場會將離子捕集到在兩個電極之間的空間中。斜坡或掃描RF電壓會將處於長期頻率或捕集狀態的離子噴射出來。有時會限制動態範圍。用於離子的體積和容量有限，因此限制了儀器的測定範圍，尤其是對複雜基質中的樣品而言。

離子阱儀器是在1980年代問世的。但這類早期儀器都採用內部游離方案，導致效能有所限制，無法運用於許多應用。等到外部游離技術問世後，這些儀器才變得更通用。

透過連續碎斷單個分析物推論出更多結構資訊（即碎斷離子、選擇特定碎片並重複該過程）的能力稱為MSn。GC層析峰不夠寬，只能執行一次碎斷（MS/MS或MS2）。離子阱儀器執行的MS/MS或碎斷實驗是基於時間，而不像四極桿和扇形儀器是基於空間。因此，這類儀器不能用於某些MS/MS實驗，例如中性丟失和前驅物離子比較。此外，在使用離子阱儀器的MS/MS實驗中，MS/MS譜圖的底部三分之一會消失，這是離子阱設計所致。為克服這類耗損，有些製造商提供軟體來因應更廣泛的掃描需求，這類軟體必須要在數據擷取期間切換操作參數，

離子阱設計對前驅物質荷比(m/z)與最低捕集碎片離子之間的比例設了上限，通常稱為「三分之一規則」。例如，由m/z 1500的前驅物離子產生的碎片離子若m/z低於500，則不會偵測到，這是胜肽從頭定序的重大限制。離子阱的動態範圍有限，這是在太多離子進入捕集空間時，由空間電荷效應產生的結果。已經有製造商開發出自動掃描功能，可以在離子進入離子阱之前計數，從而限制或控管能夠進入的數量。當大量背景離子中存在著相對少量的相關離子時，同樣會遇到困難。

由於功能設計的相似性，離子阱與四極桿儀器被結合使用，以利運用流式四極桿和離子捕集行為的優勢來提高靈敏度外，進行單獨使用任何一種儀器都無法完成的即時(on-the-fly)實驗。這類儀器有時稱為線性離子阱或Q-Trap。線性離子阱儀器的體積增加（相較於三維離子阱），有助於改善動態範圍。

離子阱儀器不會像四極桿儀器那樣進行掃描，因此在離子阱中使用單離子監測(SIM)或單離子記錄(SIR)技術不會像在四極桿和扇形儀器上一樣提高靈敏度。

快速傅立葉轉換離子迴旋加速器(FTICR)可以解析密切相關質量，能代表目前量測質量的最強能力。雖然對於大多數應用並不切實際，但14.5特斯拉的磁鐵可以達到超過350萬的解析度，從而顯示質量變化小於單一電子質量之分子個體之間的差異。

迴旋加速器儀器使用恆定磁場在捕集室中用靜電捕集離子。射頻電壓脈衝產生軌道離子運動，軌道離子在捕集室的偵測板上產生低強度訊號（離子的軌道頻率）。該頻率與離子的m/z成反比，訊號強度與捕集室中相同m/z的離子數成正比。在非常低的捕集室壓力下，迴旋加速器儀器可以長時間保持離子的運動軌道，提供非常高的量測解析度。

持續離群共振、照射、碰撞誘發解離(SORI-CID)是傅立葉轉換離子迴旋加速器共振質譜中使用的一種CID技術。離子在迴旋加速器中的運動加速，透過增加迴旋加速器中的壓力誘發離子碰撞產生碎片。碎斷結束後，降低壓力並恢復高真空，開始分析碎片離子。

飛行時間(TOF)儀器雖然是在多年前開發的，但由於它採用了快速、精確的電子技術和ESI等現代游離技術，因此一直都是許多現代工作的基礎。TOF儀器可量測準確質量，誤差在分子真實質量的百萬分率(ppm)以內。TOF儀器是一種暫時擴散質量分析器，以線性方式使用，或是在靜電網和透鏡的輔助下發揮反射管的作用。發揮反射管作用時，解析度會提高，而不會顯著降低靈敏度，也不需要加大飛行（或漂移）管的尺寸。

TOF分析會使一組離子以短暫爆發的方式加速進入偵測器。每個離子在離開離子源時都已經被「推動器」電極施加了相同的電荷或電位。每個離子的電位均會使離子加速（或者說將離子發射）進入一個非常低壓的管子內。因為所有帶相似電荷的離子都具有相同的動能（動能= ½ mv²，其中m是離子質量，v是速度），因此質量較低的離子速度更快且撞擊偵測器的時間間隔更短。由於質量、電荷和動能決定了離子到達偵測器的時間，因此可以用v = d/t = (2KE/m)^1/2表示離子的速度。離子在時間(t)內行進指定的距離(d)，其中t取決於質荷比(m/z)。由於每次「推動」都會量測所有質量，因此TOF儀器相對於掃描儀器可以發揮非常高的靈敏度。

現在的四極桿MS系統通常會以每秒10,000 Da或amu的速度進行掃描。因此即使是持續時間較短的全面掃描（例如掃描1秒的LC或GC訊號峰），仍然會在每秒內捕集到每個離子10次或更多次。TOF儀器的偵測器會記錄在奈秒內轟擊板的離子。若與四極桿等掃描儀器直接比較，這種解析度讓TOF儀器具有動態範圍更寬且靈敏度更高的附加效能。然而，一般來說，四極桿儀器在偵測複雜混合物中的目標分析物時更靈敏，因此通常是更好的定量工具。有些儀器（如離子阱）兼具這些功能。但在綜合儀器問世之前，沒有任何一種儀器能夠獨自發揮全方位的高階效能。

早期的MALDI-TOF設計（使用基質輔助雷射脫附游離）會在游離後立即將離子加速送出游離源。其解析度相對較差，準確度也有限。為MALDI-TOF儀器開發的遲延引出(DE)技術會在離子形成後「冷卻」並聚焦離子約150奈秒，接著會加速讓離子進入飛行管。冷卻後的離子比未冷卻的離子動能分佈更低，這最終會減少離子進入TOF分析器後的時間擴散，從而提高解析度和準確度。DE用於大分子（例如>30,000 Da的蛋白質）的優越性明顯較小。

混成

「混成」一詞適用於各種組合現有技術的質譜儀設計，例如雙聚焦扇形磁場質譜儀，以及近期出現的「前端」設置迴旋加速器的離子阱質譜儀。其中，四極桿飛行時間(QTOF)質譜儀是最有趣的設計之一，它結合了TOF儀器與四極桿儀器。如此配對產生了幾個效能特徵的最佳組合：準確質量量測，進行碎斷實驗的能力以及優質的定量。

質譜技術的進一步發展產生了將離子遷移量測和分離與串聯質譜組合的儀器。離子遷移質譜（註：由於「IMS」常被用作「影像質譜」的縮寫，所以我在這裡使用「IMMS」來作為「離子遷移質譜」的縮寫）是一種根據多種因素的組合來區分離子的技術，這些因素包括：離子的大小、形狀和電荷，以及質量。IMMS裝置通常用於機場和手持現場裝置，能快速（只需20毫秒）偵測遷移率已知的小分子：例如某些麻醉品和爆炸物。改用於高階儀器時，IMMS可提供正交分離維度（相對於LC和MS）和一些特有的功能，包括：

• 分離異構物、同量異位素和構形異構物（從蛋白質到小分子）並測定其平均旋轉碰撞截面
• 增強複雜混合物的分離（使用MS或LC-MS），從而增加峰容量和淨化樣品（實現離子的物理分離，特別是化學雜訊和干擾相關分析物的離子）
• 提供CID/IMMS、IMMS/CID或CID/IMMS/CID的效能，還能在結構解析研究中透過碎斷實驗獲得更多具有實質意義的資訊。

在以上所有三種分析情境中，高效離子遷移和串聯質譜的結合可以幫助您克服其他分析方法（包括傳統質譜或液相層析儀器）無法解決的分析挑戰。

本節結尾處引用H.H. Hill Jr.等人的評論性文章比較了截至該文章2007年發表前，市面上可用之各類離子遷移質譜儀，並且說明了將這些質譜儀應用於多種分析物的優勢。這篇文章主要介紹了目前與質譜聯用的四種離子遷移分離技術：

• 漂移時間離子遷移質譜(DTIMS)
• 吸入離子遷移質譜(AIMS)
• 差分遷移質譜(DMS)，也稱為場不對稱波形離子遷移質譜(FAIMS)
• 行波離子遷移質譜(TWIMS)

根據作者的說法，「DTIMS的IMS解析能力最強，並且是唯一可以直接量測碰撞橫截面的(IMMS)方法。AIMS是一種低解析度遷移分離方法，但它可以連續監測離子。DMS和FAIMS皆提供連續離子監測能力以及正交離子遷移分離能力，能夠實現高選擇性的分離。TWIMS是一種新穎的(IMMS)方法，解析能力相對較低。但是，這種方法能表現出良好的靈敏度，並且能充分整合於商用質譜儀的操作中。」

離子遷移結合MS的方式還能應用於研究生物分子的氣相結構。Pringle等人（此處引用）使用混成四極桿/行波離子遷移分離器/正交加速飛行時間儀器的系統考察了某些胜肽和蛋白質離子的遷移分離。它們將行波(TWIMS)分離裝置獲得的遷移數據與使用各種其他遷移分離器獲得的遷移數據比較後發現，「雖然遷移特性相似，但這套具有全新結構的混成儀器能在不影響質譜儀基本靈敏度的前提下進行遷移分離。這項功能有助於在具有分析意義的層面對樣品進行遷移研究。」

另請參閱：

• Special Feature Perspective: Ion mobility-Mass Spectrometry, A. B. Kanu, P. Dwivedi, M. Tam, L. Matz and H. H. Hill Jr., J. Mass Spectrom.2008; 43: 1-22 Published online in Wiley InterScience, (https://onlinelibrary.wiley.com/) DOI: 10.1002/jms.1383
  • 這項參考資料為什麼重要：簡單扼要地介紹了離子遷移與MS聯用技術。提供160項關於離子遷移質譜(IMMS)的參考資料。
    
• An investigation of the mobility separation of some peptide and protein ions using a new hybrid quadrupole/traveling wave IMS/oa-ToF instrument, S. D. Pringle, K. Giles, J. L. Wildgoose, J. P. Williams, S. E. Slade, K. Thalassinos, R. H. Bateman, M. T. Bowers, J. H. Scrivens, Published online (www.sciencedirect.com), International Journal of Mass Spectrometry (2006), doi:10.1016/j.ijms.2006.07.021
  • 這項參考資料為什麼重要：說明IMMS在生物分子方面的應用。