質譜分析入門讀本

如今，更高的量測質量準確度與解析度已經成為早期藥物開發等各類應用進行結構表徵分析的主要工具。目前有許多製造商的四極桿飛行時間(QTOF)儀器都達到相當高的專一性和實用性，因此漸漸取代其他LCMS技術。

即使有高階儀器，但QTOF儀器的質量準確度非常高，可達到單一同位素值真實計算值的百萬分之幾，再加上它的高解析度優勢（四極桿儀器的10倍），因此能支援我們根據質量虧損決定實驗式（氫和其他原子的臨界質量值是主要區別因素）。物種形成分析（例如辨別醛和硫化物之間的差異）成為可能，將質量準確度提高到四極桿極限以上，達到30 ppm，其中兩個質量相差0.035 Da。然而，甲基化相關代謝過程之間的區別則要求更高。相較於先羥基化（添加氧）然後在雙鍵處氧化（損失H₂）的兩階段生物轉化過程（質量增加+13.9792 Da），添加CH₂會導致量測質量在前驅物質量（純粹藥物訊號值）基礎上增加+14.0157 Da。不過，如受限於標稱解析度（典型的四極桿訊號值），這兩種方式的量測值看起來都像+14 Da。

高質量準確度與低解析度

低解析度四極桿儀器在對質量準確度要求極高的量測中表現良好，例如用於蛋白質分析的儀器。當同位素峰之間沒有彼此相對解析時，通常會將蛋白質的質量定義為「平均」值。平均質量是分子中所有同位素物種的加權平均值。四極桿儀器通常採用的儀器解析度將10 kDa蛋白質的訊號值解析結果擴大了1.27倍。這個倍數會隨著質量增加而大幅增加（例如在質量為100 kDa時會增加到2.65倍）。但是，只要將峰寬減少到m/z 0.25（將解析度提高到4000），而不使用典型峰寬(m/z 0.6)將儀器解析度限制在1000，就能顯著改善這種情況。

在實際應用中，大分子的ESI-MS分析會產生帶多電荷離子。因此需將峰寬除以離子的電荷數，計算出以質荷比為標尺的峰寬。例如，帶有10或20個電荷的20 kDa蛋白質將在m/z約2000或約1000處分別產生峰寬為0.9或0.45m/z單位的同位素包膜。

當在儀器上觀察這些離子的解析度明顯低於觀察同位素所需的解析度時（例如解析度小於10,000），每個電荷態各會產生一個訊號峰。將儀器峰寬與同位素包膜理論峰寬相加後除以離子電荷數，即可確定總峰寬。儀器峰寬會在低分子量化合物的第一個同位素峰確定，其m/z值與多電荷蛋白質峰相同。

需達到多高的準確度，或者實際上能夠達到多高的準確度？有哪些折衷方案？

讓我們來看看《美國質譜學會期刊》(Journal of the American Society for Mass Spectrometry)作者準則（2004 年 3 月）對於「明確表徵分析」的要求。對於C、H、O、N組成的化合物（C_0-100、H_3-74、O_0-4和N_0-4），118處的標稱質荷比訊號值只需要不超過34 ppm的誤差即可視為「明確表徵分析」，而750處的m/z訊號值需優於0.018 ppm的精密度才能消除「所有外來物質的可能性」。

比較不同儀器的精密度：毫質量單位(mmu)、量測誤差(ppm)和解析度

根據VIMMS計劃（英國國家量測系統之部分舉措）制定的準確質量最佳實務指南，用於量測準確質量的儀器大多都能達到10 ppm或更高的精密度。

用準確度範圍在2 mmu內的現代質譜儀量測的118 Da計算質量會呈現出17 ppm的誤差，按照今天的標準，足以明確測定該質量的化學式：

單一同位素的精確質量計算值 = 118 Da

測得的準確質量 = 118.002 Da

差值 = 0.002 mmu

誤差 [差值/精確質量 x 106] = 17 ppm

如果是一台能夠在750 m/z下產生訊號的儀器，且差值也達到2 mmu，準確度會達到2.7 ppm。在第一種情況下，根據《美國質譜學會期刊》所發表的標準，量測結果足以明確鑑定化學式。但在後一種情況下，量測值的精密度則不足。只有最高階傅立葉轉換離子迴旋共振質譜(FTICR)才能在更高的質量下達到這樣的精密度。

要評估儀器質量準確度量測能力是否符合預定用途，有一種全面方法就是計算均方根或RMS誤差。為說明其用途，以下內容改編自商用TOF質譜儀的質量量測精密度規格。

「在正常運作條件下，使用合適的參比峰（指定m/z）對分析物峰（指定m/z）進行連續重複量測，儀器在指定m/z範圍內的質量量測精密度應優於指定ppm RMS。分析物和參比峰的強度必須足夠高，且不受其他質量的干擾。」

需考慮幾項要點和假設：

1. 已經使用校正標準品對已知質量的峰進行了儀器校正。參比峰用於說明儀器校正隨時間出現的任何變化，質量量測準確度由分析物峰確定。
2. 正常運作條件 - 還可以包括層析分離條件（LC-MS效能規格）以及任何相關MS運作條件（例如質量解析度、相關m/z或譜圖採集速率）的詳細資訊。
3. 足夠的強度 - 假設離子計數不會對相關儀器的（質量量測）準確度和精密度表徵分析造成不利。離子太少會導致離子統計數據較差，離子太多會導致偵測器飽和，這兩種情況都會導致重複量測的標準偏差發生較大變化，並將對RMS誤差的計算產生不利影響（也與儀器校正有關）。
4. 無干擾 - 假設已知質量的峰的質量測量不受相同或類似質量的離子干擾。重疊峰會導致質量量測精密度較差，也不利於正確表徵分析儀器的準確度或精密度（也與儀器校正有關）。
5. 參比峰能夠很好地代表與特定樣品類型的分析相關的m/z範圍。

RMS誤差使用以下關係式計算，其中E_ppm是ppm誤差，n是考慮的質量：

值得注意的是，RMS誤差允許一些量測值落在ppm誤差的「相關範圍」之外（例如5 ppm RMS）。為確保能得到優質的量測值，需要多次重複進樣才能符合上述條件（特別是關於強度和干擾的影響 - 得到平衡的離子統計數據，讓譜圖中具有清晰的峰定義）。您所見的許多解析度和質量準確度數值並非RMS誤差數值，而是來自單一個選定的（有利）離子。

一定要記住，在所有應用中，弱訊號（解析度過高）會產生較差的離子統計數據，可能無法使用。訊號太強可能同樣無用，會導致偵測器器飽和。我們的目標是在譜圖中得到可以定義、達到理想均衡的離子統計數據。

關於圖的一些比較：

• 四極桿解析度不足以區分上圖中的兩種化合物。
• TOF數據的解析度約5000，可以清楚顯示兩個不同的訊號峰，並準確量測質量，誤差<5 ppm。

一定要透過質量定義與解析度增加和峰型及校正需求等因素之間的轉變，瞭解決定準確質量量測精密度中彼此相關的各種作用。如果未能清楚理解和思考這幾點，可能會發生大規模的分配錯誤和其他不良後果。

圖中不同成分的兩個碎片來自同一個分析物，因此同時存在於源中。在這種情況下，即使是最好的層析分離也無濟於事，因此這凸顯出更高解析度有用的原因之一，特別是在分析未知物時。這同樣適用於QTof產物離子數據與來自三段四極桿的產物離子數據。這種更高解析度的額外優勢在於，每種離子的萃取離子流(XIC)圖允許從層析圖中選擇性地區分含氧和含烷基的分析物，四極桿數據就缺乏這種能力。

請參閱MS – The Practical Art, LCGC

• Debating Resolution and Mass Accuracy, Vol.22 No.2, 118 – 130, February 2004
  • 這項參考資料為什麼重要：探討實務用途核心方面的許多問題，並附上來源於業界的比較
    
• Petroleomics: MS from the ocean floor, Vol.26, No.3 March 2008
  • 這項參考資料為什麼重要：討論最高解析度儀器的實用性，並且比較這些用途與人們對儀器的實際期望。

另請參閱：

• Methodology for Accurate Mass Measurement of Small Molecules, K. Webb, T. Bristow, M. Sargent, B. Stein, Department of Trade and Industry’s VIMMS Program within the UK National Measurement System, (LGC Limited, Teddington, UK 2004).VIMMS 2004 guidance document
  • 這項參考資料為什麼重要：簡單扼要地介紹哪些問題嚴重影響準確質量量測工作。
    
• Dealing with the Masses: A Tutorial on Accurate Masses, Mass Uncertainties, and Mass Defects, A. D. Leslie and D. A Volmer, Spectroscopy, Vol.22, No.6 June 2007
  • 這項參考資料為什麼重要：從基本主題出發，延伸探討Kendrick質量虧損以及胜肽和蛋白質的標記。

磺胺雙甲嘧啶標稱質量 = 278

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

平均質量 –使用每種元素的所有同位素及其自然豐度進行計算。

磺胺雙甲嘧啶平均質量 = 278.3313

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

精確質量計算值 –（單一同位素）。將指定離子的各個同位素質量加總求和決定。

磺胺雙甲嘧啶精確質量 = 278.0837

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

準確質量 –（實際「測得的精確質量」）。這是我們用儀器量測的結果？它是m/z量測值，（通常）取到小數點後第三或第四位。

質量越大，定義之間的差異也隨之增加，峰型就能發揮更大的作用：

泛素標稱精確質量平均值

[C₃₇₈H₆₃₀N₁₀₅O₁₁₈S] 8556 8560.6254 8565.8730