질량분석 입문서

전자 이온화(EI)

많은 사람들이 전자 이온화(EI)에 대해 잘 알고 있습니다. (기존에 종종 "전자 충돌"이라는 용어를 사용했었지만 기술적으로는 정확하지 않은 표현입니다.) EI는 샘플을 70eV 전자에 노출시키는 방식으로 수행되는 경우가 많으며 "하드" 기술이라고 부릅니다. 관심 분자와 상호 작용하는 전자의 에너지는 일반적으로 결합에 포함된 에너지보다 훨씬 더 크기 때문에 이온화가 발생합니다. 과잉 에너지는 특성을 잘 드러내는 방식으로 결합을 끊습니다. 그 결과 분자가 무엇인지 추정할 수 있는 예상 가능하고 식별 가능한 조각이 얻어집니다. 외부 셸(shell)에서 전자만 추출하면 양의 모드(M.+)에서 라디칼 양이온 및 풍부한 조각 스펙트럼이 생성됩니다. 때로 제조업체의 특정 소스 설계에 특징적인 스펙트럼 반응을 생성하는 "더 소프트한" 대기압 이온화 기술과 달리 EI 기술은 소스 설계 면에서 상당히 독립적입니다. 하나의 EI 기기에서 생성된 스펙트럼은 다른 EI 기기에서 생성된 동일한 화합물의 스펙트럼과 매우 유사하며, 이는 미지의 스펙트럼을 참조 스펙트럼에 매칭시키는 스펙트럼 라이브러리를 생성하는 데 도움이 됩니다.

화학적 이온화(CI)

과도하게 조각화된 분자에는 "소프트" 기법이 요구됩니다. 화학적 이온화(CI)는 분자 이온 자체의 모양을 보존하고 촉진하는 보다 부드러운 양성자 전달 과정을 통해 이온을 생성합니다. 샘플은 메탄이 양성자화 분자 이온(M+H)을 형성할 때 발생하는 것과 같은 과도한 시약 기체에 노출됩니다. 반대 과정을 통해서는 음이온을 생성할 수 있습니다. 양성자를 기체 분자로 전달하면 경우에 따라 음이온(M-H)이 생성될 수 있습니다.

EI로 분석한 것과 유사한 화학 물질을 가진 화합물에 화학적 이온화(CI)를 사용하여 유의한 조각화에 보다 적합하게 분자 이온의 존재비나 모양을 향상시키기도 합니다. EI와 마찬가지로, 소스에서의 가열로 기화가 발생하므로 샘플은 열적으로 안정적이어야 합니다. CI의 이온화 메커니즘은 초기 이온화 단계에서 EI에 의존하지만 소스 내부에는 고압에서 메탄, 이소부탄 또는 암모니아와 같은 화학 시약 기체가 있습니다. 분석물(R)보다 훨씬 높은 농도로 존재하는 시약 기체는 전자 이온화를 통해 이온화되어 1차 R+ 시약 이온을 제공합니다. R+의 충돌. 중성 R 분자를 가진 이온은 안정적인 2차 이온을 형성하며, 이 이온은 반응종이 되어 이온 분자 반응에 의해 분석물 분자(A)를 이온화합니다.

예를 들어 메탄 이온과 메탄 분자 사이의 이온 분자 반응은 상당히 안정적인 CH₅⁺ 종을 생성합니다.

CH₄^+. + CH₄  --> CH₅⁺ + CH₃^.

반응 이온 CH₅⁺는 양성자 전달, 수소화물 분리 또는 전하 교환을 통해 중성 분석물 분자(A)를 이온화할 수 있습니다.

RH⁺ + A --> R + AH⁺(양성자 전달)

(R-H)⁺ + A --> R + (A-H)⁺(수소화물 분리)

R+^. + A --> R + A^+.(전하 교환)

가장 일반적인 이온화 반응은 양성자화이며 시약보다 높은 양성자 친화도를 가진 분자에 적합합니다. 수소화물 분리는 양성자 친화도가 낮은 분자에 일반적이며 이온화 에너지가 높은 시약에서 전하 교환이 발생합니다.

분석할 물질은 시약 기체보다 압력이 훨씬 낮습니다. 메탄을 시약 기체로 사용하고자 할 경우 전자 충돌로 메탄의 이온화가 주로 발생합니다. 이는 부분적으로 CH₃⁺로 조각화됩니다. 그런 다음 이러한 종은 높은 소스 압력 조건이 적용될 경우 이온 분자 반응을 거칩니다.

CH₄^+. + CH₄  --> CH₅⁺ + CH₃^.

CH₃⁺ + CH₄  --> C₂H₅⁺ + H₂

CH₅⁺는 Bronsted 산으로 작용하고 C₂H₅⁺는 Lewis 산으로 작용하여 분석물에서 이온을 생성합니다.

화학 이온화 가스의 기체상 산성도가 전하 전달 효율성에 영향을 미치기 때문에 CI 시약 기체를 신중하게 선택하면 분석물 분자로의 전하 전달을 개선할 수 있습니다. CI에서 분석물은 조각화가 감소하여 분자 이온을 유발할 가능성이 높으며 EI에서 일반적으로 내재된 에너지를 보존하여 결합을 끊습니다.

음이온 화학 이온화(NCI)

변형인 음이온 화학 이온화(NCI)는 전자 포획 모이어티(예: 불소원자 또는 니트로벤질기)를 포함하는 분석물에 수행할 수 있습니다. 감도는 EI보다 몇 배(경우에 따라 100배~1000배 더 높은 것으로 보고됨) 더 높아질 수 있습니다. NCI는 전자 포획을 촉진하기 위해 화학적으로 변형되거나 변형될 수 있는 다양한 저분자에 적용할 수 있습니다.

음이온에는 음이온이 생성되는 두 가지 기본 메커니즘이 있습니다. 즉, 전자 포획 및 반응 이온의 화학적 이온화입니다. CI 조건에서는 음전자 분자가 열전자를 포획하여 음이온을 생성할 수 있습니다. 진정한 음이온 화학 이온화는 분석 화합물(AH)과 음전하 반응 이온(R)의 반응에 의해 발생합니다(R^- 또는 R^-). 몇 가지 유형의 이온-분자 반응이 발생할 수 있으며 가장 일반적인 것은 양성자 추상화(proton abstraction)입니다.

AH + R^-  --> A^- + RH

반응 이온의 양성자 친화도(염기성)가 증가함에 따라 양성자 추상화가 일어날 가능성이 더 높아집니다.

가스 크로마토그래피(GC)

아마도 많은 사람들은 가스 크로마토그래프의 검출기를 통해 질량분석기를 처음 접할 것입니다. GC-MS 기기 유형의 범위가 확장되어 초기 기기 설계의 한계를 초월하거나 환경 분석, 식품 안전 선별, 대사체학 및 법의학, 독성학 및 약물 검사와 같은 임상 응용 분야에서 점점 더 엄격해지는 규제 요건을 충족할 수 있게 되었습니다.

과거에는 자기 섹터와 단일 Quadrupole 기기라는 두 가지 유형의 질량분석기가 GC-MS 분석을 지배했습니다. 고분리능과 accurate-mass 분석을 제공하는 자기 섹터형 기기는 매우 높은 감도를 필요로 하는 응용 분야에 사용되었습니다. Quadrupole 기기는 타겟 화합물의 일상적인 분석에 사용되었습니다.

환경/산업 샘플에 포함된 다이옥신 또는 경쟁 스포츠에서 경기력 향상 약물의 불법 사용에 대한 검사 등 가장 까다로운 GC-MS 분석에는 자기 섹터형 기기가 사용되었습니다. 자기 섹터형 기기는 높은 분리능/선택도에서 펨토그램 검출 수준을 쉽게 달성합니다.

Quadrupole GC-MS 시스템은 도입 직후, 타겟 분석 응용 분야에서 수용되었습니다. USEPA 분석법은 다양한 환경 오염 물질의 샘플 분석에 Quadrupole GC-MS 기기 사용을 명시하고 있습니다. 이러한 응용에는 피코그램-나노그램 수준의 검출만 요구되기 때문에 섹터형 기기에 비해 Quadrupole 기기의 낮은 선택도가 제약을 가하지 않습니다. 그에 반해 대폭 절감된 비용, 사용 편리성 및 휴대성은 탁월한 이점입니다.

액체 크로마토그래피(LC)

GC로 도달할 수 없는 화학 물질의 약 80%에 대한 분석을 제공하는 이 혁신적인 기술은 최근 수십 년간 질량분석기에 경이로운 성장과 관심을 불러 일으켰습니다. 몇 명의 사람들에 의해 LC와 MS가 결합되었습니다('간략한 역사' 섹션 참조). 오늘날 우리가 알고 있는 LCMS는 1970년대에 시작되어 1990년대 초에 성숙해졌습니다. 오늘날 우리가 실제로 사용하는 많은 장치와 기술은 그 당시로부터 직접 전해져 내려온 것입니다.

액체 크로마토그래피는 1900년대 초 러시아 식물학자인 Mikhail S. Tswett의 연구에서 정의되었습니다. 그의 연구는 입자로 충전된 컬럼에 용매를 사용하여 식물에서 추출한 잎으로부터 색소를 분리하는 데 중점을 두었습니다. 가장 단순한 형태의 액체 크로마토그래피는 충전된 입자 층(고정상)을 통해 전달되는 용액(이동상 또는 응축상) 내 분석물 간의 경쟁적 상호 작용을 높은 정밀도로 예측하고 재현하는 기능을 수행합니다. 최근 몇 년 동안 다양한 기능적 모이어티로 충전된 컬럼을 개발하고 이동상을 정확하게 전달할 수 있는 용매 전달 시스템이 나오면서 LC는 많은 산업의 분석 중추로 자리잡았습니다.

1970년 Csaba Horváth는 충전된 컬럼에서 액체 크로마토그래피에 필요한 흐름을 생성하는 데 고압을 사용한다는 것을 나타내기 위해 HPLC라는 약어를 도입했습니다. 그 이후로 더 작은 입자의 개발과 선택도의 향상을 포함하여 성능이 지속적으로 발전하면서 이 약어는 고성능 액체 크로마토그래피를 나타내는 것으로 의미가 바뀌었습니다.

2004년에는 기기와 컬럼 기술이 더욱 발전하면서 액체 크로마토그래피의 분리능, 속도 및 감도가 크게 향상되었습니다. 입자 크기가 작은 컬럼[1.7마이크론]과 15,000psi[1,000bar]에서 이동상을 전달하도록 설계된 특수 기능을 갖춘 기기가 초고성능 액체 크로마토그래피라는 차별화된 의미를 가진 용어를 일컫는 UPLC 기술로 알려지게 되었습니다. 이 현대적인 기술에 구현된 대부분은 1970년대 John Knox와 같은 연구가들이 예측한 것입니다. Knox는 최적의 입자 직경이 1-2μm이고 크로마토그래피가 마찰 열에 열적으로 민감할 것이라고 예측했습니다. 보편적 사용을 위해 UPLC를 개발하는 과정에서 강력하고 균일한 작은 입자를 개발할 수 있는 기술이 필연적으로 발견되고 구현되었습니다. HPLC 및 UPLC에 대해 유용한 내용이 담긴 기본 입문서를 확인하세요.

ESI(전자 분무)

일반적으로 사용하는 "대기압 이온화"(API)라는 용어에는 가장 주목할만한 기술인 전자 분무 이온화(ESI)가 포함됩니다. 이 기술은 진공이 아닌 대기압에서 이온을 생성할 수 있는 다양한 관련 기술의 기초를 제공합니다. 샘플은 극성 용매(일반적으로 GC에 사용되는 것보다 휘발성이 낮음)에 용해되고 2000~4000V를 전달하는 스테인리스 스틸 모세관을 통해 펌핑됩니다. 액체는 대기압에서 모세관을 나가면서 에어로졸화되고 정전기 인력과 진공의 결합된 효과에 의해 탈용매화된 액적이 질량분석기로 흐르는 이온을 방출합니다.

액체에서 분석물로 전위가 이동하여 이온을 생성하는 메커니즘은 지금까지도 논란의 대상입니다. 1968년 Malcolm Dole은 액적이 증발해도 전하가 변하지 않는다는 가설을 바탕으로 한 전하 잔류 메커니즘을 처음 제안했습니다. 액적의 표면장력은 결국 부여된 전하의 반발력에 대항하기 어려워 많은 작은 방울로 비산됩니다. 이러한 쿨롱 분열(Coulombic fissions)은 단일 분석물 이온을 포함한 액적이 남을 때까지 일어납니다. 마지막 액적의 용매가 증발할 때 기체상 이온이 형성됩니다.

1976년 Iribarne과 Thomson은 이온 증발 메커니즘이라는 다른 모델을 제안했는데, Dole의 모델에서 형성되는 방식과 유사하게 쿨롱 분열에 의해 작은 액적이 형성된다는 내용을 골자로 합니다. 그러나 이온 증발 이론에 따르면 액적 표면에서의 전기장 강도가 충분히 높아서 이온이 액적 표면을 벗어나 에너지적으로 용매화된 이온에 적합한 가스 상으로 직접 이동할 수 있습니다.

두 메커니즘은 실제로 서로 조화롭게 작동할 수 있습니다. 전하 잔류물 메커니즘은 3000Da 이상의 질량에서 지배적이고 이온 증발 메커니즘은 낮은 질량에서 지배적입니다(참고 문헌: R Cole, Some tenets pertaining to Electrospray ionization mass spectrometry, J of Mass Spec, 35, 763–772 (2000)).

액체 크로마토그래피의 액체는 전하 균형 상태에서 ESI 프로브로 들어갑니다. 따라서 용매가 ESI 프로브에서 벗어나면 순이온 전하를 전달합니다. ESI가 연속적인 기술이 되도록 하려면 전자가 전극 역할을 하는 전도성 표면으로 이동하는 전기화학 반응을 통해 용액을 대전시켜야 합니다. 다른 영향 중에서도 특히 이 과정은 pH 변화를 유발할 수 있습니다. 양의 모드에서는 양전하를 띤 액적이 분무에서 나오고 전극이 전자를 받아들인다고 가정합니다(산화). (음의 모드에서는 그 반대가 됩니다.) 전기 활성 전극의 표면적, 전류의 크기, 화학종의 특성 및 전극 전위가 모두 영향을 미칩니다.

무엇보다도 ESI는 효율적인 프로세스입니다. 그러나 개별 종에 대한 전체적인 반응의 활성 에너지와 에너지 차이는 다릅니다. 용액의 유속과 적용된 전류가 각 액적에 대한 한계를 정의합니다. 분자 간에 경쟁이 발생하고 관심 분석물이 억제되는 일이 흔하게 일어납니다.

액체를 매우 적은 양으로 줄이는 것과 같은 기본 ESI 이론의 확장(예: 나노스프레이의 경우 30nL/분)은 특히 단백질과 아미노산에 대한 제한된 샘플 연구에서 효과적인 것으로 입증되었습니다.

APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization)

APCI를 시연하는 연구가 ESI와 병행하여 발표되었지만 APCI는 1985년 Fenn의 연구를 계기로 ESI가 상용화되기 전까지는 널리 채택되지 않았습니다.

Horning은 1973년에 APCI를 처음 도입하여 다양한 주입 기술을 통해 휘발성 화합물을 분석했는데 그중 하나가 HPLC였습니다. APCI의 부가적인 기능 덕분에 ESI에 의한 기체상 이온으로의 전환이 잘 되지 않는 분석물, 즉 응축상 또는 액체 흐름에서 질량분석기로 주입되는 극성이 낮고 휘발성이 더 강한 분석물을 분석할 수 있습니다. ESI와 달리 APCI는 가열된 기체 흐름에서 주입된 액체를 기화시켜 중성 분석 물질을 기체 상태로 전달합니다. 화학적 이온화는 시약 이온과 타겟 분자 사이에 전하를 띤 종의 이동에 의존하여 질량분석이 가능한 표적 이온을 생성합니다. 일반적으로 양이온 모드에서 타겟 분자와 작은 H⁺ 이온 사이에 부가물이 형성되는 경우가 많지만 염이 있는 부가물도 흔합니다. 예를 들어, 이동상에 약산-약염기 염인 초산 암모늄이 존재하는 경우 암모늄 부가물인 (M+NH₄)⁺가 형성될 수 있는데, 이는 휘발성이 낮고 이온성이 높은 인산염 완충액 대신 자주 사용되는 변형제(modifier)입니다. 높은 염 농도에서 양성자화된 형태와 암모니아화된 형태 사이의 경쟁은 둘 모두에 대해 반응을 감소시킬 수 있습니다. APCI로 인해 형성될 수 있는 이온의 최대 수는 시약 이온이 중복으로 형성되기 때문에 ESI에서보다 훨씬 많습니다. 액체는 일반적으로 용융 실리카 유리로 된 비전도성 튜브를 통과하며 그 주위에는 분무 가스가 흐릅니다. 결과적으로 생성되는 미세 액적은 비전도성 튜브의 끝을 넘어 확장되는 튜브 또는 프로브의 가열된 내부 벽과 충돌하여 기체 상태로 변환됩니다. 이 이온화 유형은 일반적으로 전자분무와 관련된 HPLC 또는 UPLC(초고성능 액체 크로마토그래피) 유속보다 훨씬 높은 선형 속도로 수행되는 경우가 많습니다. 그러나 오늘날 사용되는 기기는 모든 에어로졸 의존 기술의 성능을 향상시키는 훨씬 더 큰 탈용매화 기능을 제공합니다.

탈용매화된 분석물 분자는 화학적 이온화를 통해 이온화됩니다. 이온화 전위는 ESI에서와 같이 액체를 통과하지 않고, 액적이 통과하는 플라즈마 또는 코로나 등의 니들 팁에 적용됩니다. 실제로 이동상은 전하를 분석물에 전달하는 매개체 역할을 합니다. 따라서 APCI에는 처음에 "용매 매개 전기 분무"라는 이름이 부여되었습니다.