질량분석기 입문서

많은 개별 샘플에서 통계 데이터를 수집하고 투여된 약물과 관심 대사산물이 이미 잘 특성화되어 있는 임상 시험에서와 같이 화합물이 이미 알려진 경우에는 전체 질량 스펙트럼이 필요하지 않습니다. 그러나 복잡한 생리적 혼합물에서는 매우 높은 감도가 필요하므로 기기는 특정 m/z 값만 모니터링하도록 설정됩니다. (이 입문서의 이전 내용에서 SIR 및 MRM 반응 비교 참조).

이온은 Triple 또는 Tandem Quadrupole을 통해 지속적으로 흐르기 때문에 질량분석기로 유입되는 이온 흐름을 제한할 필요가 없습니다. 반면에 이온 트랩은 한정된 부피를 가지므로 너무 많은 이온이 트랩으로 들어가는 것을 방지하는 기능이 필요합니다. 이온 강도를 제어하지 않으면 스펙트럼에서 바람직하지 않거나 예상치 못한 피크가 발생하여 GC-MS에서 EI 스펙트럼 라이브러리 검색을 시도할 때 특히 문제가 되는 현상이 발생합니다. 이온 트랩의 설계는 내부 이온화(질량 필터 내 이온화)가 아닌 외부(이어지는 이온이 트랩에 주입되는 질량 필터 외부에서 생성된 이온) 이온화가 가능하도록 많은 변화를 겪었습니다. 설계 변경에 따라 트랩의 이온 분자 반응 문제는 해결했지만 제한도 있었습니다. MRM 모드에서도 총 이온 흐름을 이렇게 자동으로 제어하면 전체 크로마토그래피 피크에 걸쳐 샘플링 간격이 불규칙해질 수 있습니다. 따라서 궁극적으로 이온 트랩은 복잡한 매트릭스에서 미량 분석을 위한 도구로 제한되며, 특히 적법성을 입증해야 하거나 정량화의 정확성 및 정밀도에 대한 엄격한 기준이 법률에 의해 규정된 데이터의 경우와 같이 매우 높은 정확도와 정밀도가 필요한 경우로 국한됩니다.

내부 표준물질은 일반적으로 MS 정량화를 수행할 때 사용됩니다. 이 표준물질은 추출 프로세스, LC 주입 및 이온화에서 발생하는 변동성을 제어합니다. 내부 표준물질이 없는 경우, 반복 측정 사이의 RSD는 표준물질을 참조하는 반복 측정(일반적으로 낮은 한 자릿수의 RSD를 가짐)보다 10배 더 높을 수 있습니다. 최고의 내부 표준물질은 분석하고자 하는 분자의 동위원소로 표지된 분자입니다. 이러한 분자를 합성하는 데는 비용이 많이 들지만 질량분석기에서 유사한 추출 회수율, 크로마토그래피 머무름 시간 및 이온화 반응을 나타냅니다.

시스템 적합성 평가, 샘플 무작위화, 적합한 곡선과 농도점 결정은 긴 설명이 필요한 주제들입니다. 몇 가지 유용한 참고 자료는 https://www.ionsource.com/tutorial/msquan/requantoc.htm에서 확인할 수 있습니다.

검량

검량 화합물은 질량분석기 작업자가 질량 검량 스케일과 이온의 상대적 강도를 조정하여 알려진 개체의 강도와 매칭시키기 위해 사용합니다. Electronics(전자 기기)의 미세한 변화, 표면의 청결도, 실험실의 주변 조건이 의미 있는 측정을 재현하는 기기의 성능에 영향을 줄 수 있기 때문에 이 작업은 모든 질량분석기에서 수행됩니다. 명목 질량분석기에서 가장 부담이 없는 분석을 수행하는 경우 검량을 자주 수행할 필요가 없고 반응 확인을 더 자주 수행할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 높은 질량 정확도를 위해서는 미세한 변화를 지속적으로 점검해야 합니다.

GCMS의 경우 널리 사용되는 검량 화합물은 FC-43(perfluorotributylamine이라고도 함)입니다. 고분해능 질량분석기의 검량 스케일을 조정하는 데 다른 검량 화합물들의 혼합물이 사용됩니다. LCMS에는 요오드화세슘나트륨(NaCsI) 및 폴리에틸렌 글리콜 혼합물이 보편적으로 사용됩니다. LCMS 호환 용매에서 NaCsI를 안정적인 상태로 기기에 흘리거나 주입하면 4000Da까지 일련의 단일 동위원소 피크가 나타납니다.

MALDI(matrix-assisted, laser-desorption ionization, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화) 질량분석기의 검량, 튜닝 및 감도 테스트를 위한 표준 펩타이드, 단백질, 매트릭스 및 용매가 포함된 키트를 사용할 수 있습니다. Sigma Aldrich에서 제공하는 키트는 단백질과 펩타이드의 복합 혼합물(700~66,000Da)을 분석하기 위한 구성에 도움을 줍니다.

고정 질량(Lock Mass)

TOF 및 이와 유사한 정확도가 높은 기기를 사용하여 가장 까다로운 측정을 수행하기 위해서는 지속적인 주의가 필요합니다. 온도의 작은 변화만으로도 보고된 질량 결과에서 ppm 수준의 차이가 발생할 수 있습니다. 사용된 이온화 유형에 따라 소스에 존재하는 알려진 오염 물질을 사용하여 간단하게 지속적인 검량 작업을 수행할 수 있습니다. 또는 이온 스트림을 주기적으로 샘플링하여 분석 전반에 걸쳐 적절한 검량 상태를 재수립할 수 있습니다. 컬럼 뒤와 질량분석기의 주입구 앞에 고정 질량(lock mass) 검량체를 "보태어" LC 용리액에 단순히 추가하기만 하면 이온 억제, 질량 간섭 및 용매 효과와 같은 제어되지 않는 동작이 발생할 수 있습니다.

TOF(Time-of-Flight) 기기(본 입문서 앞부분에서 설명함)는 낮은 ppm 수준의 정확도에 도달할 수 있으며, 유입된 이온 수가 잘 제어된다면 FTCR(퓨리에 변환 이온 사이클로트론 공명) 기기는 훨씬 더 높은 정확도를 제공할 수 있습니다. 모든 질량 이동을 보정하여 고정 질량(lock mass)을 실시간으로 다시 검량하면 질량 스케일 검량으로 수립된 질량에 상대적인 질량 오차가 제거됩니다. 약한 신호는 종종 간과되는 또 다른 원인으로, LC 피크 전반에서 질량 측정의 평균을 구하고 신호 강도에 따라 가중치를 부여하여 해결할 수 있습니다.

정확한 질량(exact mass) 데이터 수집에 최적화된 이중 전자 분무 소스는 단백질체학 연구 또는 낮은 수준의 대사산물 식별에 이상적입니다. 두 개의 독립적인 ESI 프로브를 사용하는 이 분석법은 프로그래밍 가능한 스테퍼 모터로 구동되는 진동 배플을 사용하여 검량 분무(또는 참조) 스트림을 샘플링합니다. 참조 분무는 사전 정의한 간격으로 샘플링되어 수집 작업 주기에 분석물이 포함된 액체 흐름에 선택성을 나타내도록 합니다. 샘플링 배플 위치가 실시간으로 모니터링되므로 두 액체 주입구의 인덱싱이 가능하며 참조 데이터와 샘플 데이터가 별도의 파일에 저장됩니다. 이 설계에서는 분석물과 참조 채널 간의 혼선이 배제됩니다.