질량분석기 입문서

질량 정확도 및 분리능에 대한 측정 수준이 높아짐에 따라 이것은 이제 초기 약물 발견을 넘어 다양한 응용 분야에서 구조적 특성화를 위한 주요 도구가 되었습니다. 폭넓은 특이성과 유용성을 갖춘 Quadrupole time-of-flight(QTOF) 기기는 오늘날 많은 제조업체에서 제공하고 있으며 다른 LCMS 기술을 대체하고 있습니다.

더 높은 차원의 기기가 존재하지만 QTOF 기기의 높은 질량 정확도는 실제 계산된 단일 동위원소 값의 수 ppm 이내이며, Quadrupole 기기보다 최대 10배 높은 분리능을 통해 질량 손실에 따라 실험식을 측정할 수 있습니다(수소 및 기타 원자의 임계 질량 값이 차별화 요소로 작용함). 종분화 분석 - 예를 들어 Quadrupole 한계를 초과하는 질량 정확도가 30ppm까지 높아지면 알데히드와 황화물(두 질량은 0.035Da 만큼의 차이가 있음)의 차이를 식별하는 분석이 가능합니다. 그러나 메틸화와 관련된 대사 과정 간의 구별은 더 까다롭습니다. CH₂를 추가하면 측정된 질량의 precursor(약물 단독의 반응)보다 +14.0157Da가 증가하며 히드록실화(산소 추가)에 이어 이중 결합에서 산화(H₂ 손실)를 수반하는 2단계 생체 내 변형과 비교하여 +13.9792Da 증가합니다. 그러나 두 측정 모두 공칭 분리능(일반적인 Quadrupole 반응)으로 제한되는 경우 +14Da로 나타날 것입니다.

높은 질량 정확도 및 낮은 분리능

저분리능 Quadrupole 기기는 단백질 분석에 사용되는 것과 같이 매우 높은 질량 정확도가 요구되는 측정에 적합합니다. 단백질의 질량은 동위원소 간의 피크 분리가 불가능할 때 일반적으로 "평균" 값으로 정의됩니다. 평균 질량은 분자에 있는 모든 동위원소 종의 가중 평균입니다. 일반적으로 Quadrupole 기기에 사용되는 기기 분리능은 10kDa 단백질의 분리능을 1.27배 확장시킵니다. 이 계수는 질량이 증가함에 따라 크게 증가합니다(예: 100kDa에서는 2.65배로 증가). 그러나 일반적인 피크 너비(m/z 0.6)를 사용하여 기기 분리능을 1000으로 제한하는 대신 피크 너비를 m/z 0.25로 줄이면(분리능을 4000으로 증가) 상황이 극적으로 개선됩니다.

실제로, 고분자의 ESI-MS 분석에서는 다중 하전 이온이 생성됩니다. 따라서 너비를 이온의 전하 수로 나누어 질량 대 전하비 배율의 너비를 제공해야 합니다. 예를 들어, 10 또는 20 전하가 있는 20kDa 단백질은 각각 m/z가 약 2000 또는 약 1000에서 너비가 0.9 또는 0.45m/z 단위인 동위원소 엔벨로프를 생성합니다.

동위원소를 분리하는 데 필요한 것보다 훨씬 낮은 분리능(예: 분리능 10,000 미만)으로 설정된 기기에서 이러한 이온이 관찰되면 각 전하 상태에 대해 단일 피크로 표시됩니다. 전체 너비는 기기 피크 너비와 동위원소 엔벨로프의 이론적인 너비를 이온의 전하 수로 나눈 값을 결합하여 측정됩니다. 기기 피크 너비는 다중 하전 단백질 피크와 동일한 m/z 값으로 저분자량 화합물의 첫 번째 동위원소 피크에서 결정됩니다.

얼마나 높은 정확도가 필요할까요? 아니면 현실적으로 얼마나 정확할 수 있으며 어떤 절충안이 있을까요?

Journal of the American Society for Mass Spectrometry 저자가 제공한 지침(2004년 3월)을 통해 명확한 특성화에 대한 요구 사항을 고려하십시오. C, H, O, N 조성(C_0-100, H_3-74, O_0-4 및 N_0-4)의 경우, 118에서의 공칭 질량 대 전하 반응은 34ppm을 초과하지 않는 오차가 있는 경우 명확합니다. 750에서 m/z 반응의 경우 "모든 불필요한 가능성"을 제거하기 위해 0.018ppm보다 높은 정밀도가 요구됩니다.

기기 간 정밀도 비교: millimass 단위(mmu), 측정 오차(ppm) 및 분리능

영국 국가 측정 시스템의 일부인 VIMMS 프로그램의 Accurate Mass 모범 사례 가이드(Accurate Mass Best Practice Guide)에 따르면 accurate mass 측정에 사용되는 대부분의 기기는 10ppm 이상의 정밀도를 달성할 수 있습니다.

현대적 질량분석기로 2mmu 정확도 이내로 118Da의 계산된 질량을 측정하면 17ppm 오차가 표시되는데, 이것은 해당 질량의 화학식을 명확하게 측정하기 위한 오늘날의 기준에 비추어 충분한 수준입니다.

단일 동위원소의 계산된 exact mass = 118Da

측정된 accurate mass = 118.002Da

차이 = 0.002mmu

오차[차이/exact mass x 106] = 17ppm

기기는 750m/z에서 반응할 수 있고 2mmu가 부족한 경우 정확도가 2.7ppm까지 달합니다. 첫 번째의 경우, 측정값은 미국 질량분석 학회 학술지(Journal of the American Society for Mass Spectrometry)에 발표된 표준에 따라 화학식을 명확하게 식별하는 데 충분한 수준입니다. 그러나 후자의 경우 측정값의 정밀도가 충분하지 않습니다. 고차 퓨리에 변환 이온 사이클로트론 공명 질량분석기(FTICR)만이 더 높은 질량에서 이러한 정밀도를 달성할 수 있습니다.

기기의 질량 정확도 측정 성능을 평가하는 포괄적인 방법은 사용 목적에 따라 평균 제곱근, 즉 RMS 오차를 계산하는 것입니다. 그 사용 방법을 설명하기 위해 상용 TOF 질량분석기의 질량 측정 정확도 사양에서 다음 사항을 조정했습니다.

"정상 작동 조건에서 기기의 질량 측정 정확도는 (주어진 m/z의)적절한 참조 피크를 사용하여 분석물 피크(주어진 m/z)의 연속적인 반복 측정을 기준으로 지정된 m/z 범위에서 주어진 ppm RMS보다 우수합니다. 분석물 및 참조 피크는 충분한 강도를 가져야 하며 다른 질량의 간섭을 받지 않아야 합니다."

다음과 같은 몇 가지 중요한 사항과 가정을 고려해야 합니다.

1. 검량 표준물질을 사용하여 알려진 질량의 피크로 기기 검량이 이미 수행됩니다. 참조 피크는 시간 경과에 따른 기기 검량의 변화를 설명하기 위해 사용되며 질량 측정 정확도는 분석물 피크를 통해 결정됩니다.
2. 정상 작동 조건 - 크로마토그래피 조건(LC-MS 성능 사양에 대해) 및 관련 MS 작동 조건(예: 질량 분리능, 대상 m/z 또는 스펙트럼 획득 속도)에 대한 세부 정보도 포함할 수 있습니다.
3. 충분한 강도 - 이온의 수가 해당 기기의 (질량 측정) 정확도 및 정밀도의 특성화에 부정적인 영향을 주지 않는다고 가정합니다. 이온이 너무 적으면 이온 통계가 부정확해질 수 있고 이온이 너무 많으면 검출기의 포화 상태가 발생할 수 있습니다. 두 가지 모두 반복 측정의 표준 편차에서 더 큰 변동을 가져오고 RMS 오차 계산에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다(기기 검량과도 관련됨).
4. 간섭 없음 - 알려진 질량 피크의 질량 측정에는 동일하거나 유사한 질량을 가진 이온에 의한 간섭이 없다고 가정합니다. 피크가 중첩되면 질량 측정 정확도가 떨어지기 때문에 기기의 정확도 또는 정밀도의 특성을 제대로 파악할 수 없습니다(기기 검량과도 관련됨).
5. 참조는 특정 샘플 유형의 분석과 관련된 m/z 범위를 이상적으로 표현한 것입니다.

RMS 오차는 다음과 같은 관계식을 사용하여 계산됩니다. 여기서 E_ppm은 ppm 오차이고 n은 고려되는 질량 수입니다.

RMS 오차로 인해 일부 측정값이 ppm 오차 "관심 범위"(예: 5ppm RMS)를 벗어날 수 있다는 점에 주목할 필요가 있습니다. 고품질 측정을 보장하기 위해서는 위에서 설명한 조건(특히 강도 및 간섭의 영향, 스펙트럼의 피크가 명확하게 구분된 균형 잡힌 이온 통계와 관련하여)이 여러 번의 반복 주입에 걸쳐 충족되어야 합니다. 보고된 많은 분리능 및 질량 정확도 수치는 RMS 오차 수가 아니라 선택된(유리한) 단일 이온에서 비롯됩니다.

모든 응용 분야에서 약한 신호(과도하게 높은 분리능)는 불량한 이온 통계를 산출하여 사용할 수 없게 될 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 신호가 너무 강해도 검출기가 포화되어 마찬가지로 사용할 수 없습니다. 스펙트럼에서 피크가 명확히 구분되는 이상적으로 균형 잡힌 이온 통계치를 목표로 삼아야 합니다.

그림에 대한 몇 가지 비교:

• Quadrupole 분리능은 위 그림의 두 화합물을 구별하는 데 충분하지 않습니다.
• 약 5000의 분리능으로 TOF 데이터는 두 개의 뚜렷한 피크를 명확하게 표시하며 5ppm 미만의 질량까지 정확하게 측정할 수 있습니다.

질량의 정의와 증가하는 분리능, 피크 모양 및 검량 필요성과 같은 요인 간의 이동을 통해 accurate-mass 정밀도에 작용하는 다양한 상호 관련된 역할을 인식하는 것이 중요합니다. 이러한 사항을 명확하게 이해하거나 고려하지 않는 경우 잘못된 질량 할당 및 기타 바람직하지 않은 결과가 발생할 수 있습니다.

그림에서 서로 다른 조성을 가진 두 조각은 동일한 분석 물질에서 나온 것이므로 동시에 소스에 존재합니다. 이 경우에는 성능이 아무리 높은 크로마토그래피도 도움이 되지 않으므로, 이것은 특히 미지 물질의 분석에서 더 높은 분리능이 유용한 이유 중 하나를 잘 보여줍니다. 이는 QTof product 이온 데이터와 Triple Quad의 product 이온 데이터에 동일하게 적용됩니다. 이러한 더 높은 분리능의 또 다른 이점으로 각각의 XIC(추출된 이온 흐름) 플롯을 통해 크로마토그램에서 산소 함유 분석물과 알킬 함유 분석물을 선택적으로 구별할 수 있습니다. Quad 데이터에는 이러한 정보가 부족합니다.

참고 문헌: MS – The Practical Art, LCGC

• Debating Resolution and Mass Accuracy, Vol. 22 No. 2, 118 – 130, February 2004
  • 이것이 중요한 이유: 업계 출처와의 비교뿐 아니라 실제 사용 측면의 핵심적인 많은 문제를 다룹니다.
    
• Petroleomics: MS from the ocean floor, Vol. 26, No. 3 March 2008
  • 이것이 중요한 이유: 최고의 분리능 기기의 유용성을 논의하고 실제 기대치와 비교합니다.

기타 참고 문헌:

• Methodology for Accurate Mass Measurement of Small Molecules, K. Webb, T. Bristow, M. Sargent, B. Stein, Department of Trade and Industry’s VIMMS Program within the UK National Measurement System, (LGC Limited, Teddington, UK 2004). VIMMS 2004 guidance document
  • 이것이 중요한 이유: accurate-mass 측정 작업의 성공에 중요한 문제에 대한 간략하고 간결한 개요입니다.
    
• Dealing with the Masses: A Tutorial on Accurate Masses, Mass Uncertainties, and Mass Defects, A. D. Leslie and D. A Volmer, Spectroscopy, Vol. 22, No. 6 June 2007
  • 이것이 중요한 이유: Kendrick 질량 결손과 펩타이드 및 단백질에 대한 표지 지정을 포함하여 기본 주제를 확장합니다.

설파메타진(Sulphamethazine) 공칭 = 278

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

평균 질량 – 각 원소의 모든 동위원소와 자연적 존재비를 사용하여 계산합니다.

설파메타진(Sulphamethazine) 평균 질량 = 278.3313

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

계산된 exact mass – (단일 동위원소). 지정된 이온에 대한 개별 동위원소 질량을 합하여 측정됩니다.

설파메타진(Sulphamethazine) exact mass = 278.0837

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

Accurate mass – (실제로 "측정된 exact mass"). 당사 기기로 우리가 하는 일. 일반적으로 소수점 세 자리 또는 네 자리까지 보고되는 m/z의 측정값입니다.

질량이 증가하면 정의 간의 차이가 증가하고 피크 모양이 더 중요한 역할을 합니다.

유비퀴틴 공칭 정확한 평균

[C₃₇₈H₆₃₀N₁₀₅O₁₁₈S] 8556 8560.6254 8565.8730