질량분석기 입문서

용매는 일반적으로 분석하고자 하는 화합물의 용해도 및 LC-MS에 사용되는 다양한 이온화 기술과의 호환성을 기준으로 선택됩니다. ESI 및 기타 대기압 이온화 기술에서는 휘발성과 양성자를 공여하는 용매의 기능이 중요합니다.

메탄올과 같은 양성자성 일차 용매 및 1:1 메탄올/물 또는 1:1 아세토니트릴/H₂O와 같은 물이 포함된 혼합물이 사용됩니다(물/메탄올 혼합물은 발열 반응으로 인해 순수한 용매인 물이나 메탄올보다 점도를 훨씬 증가시킴). 물은 상대적으로 증기압이 낮아 100%로 사용할 경우 감도에 악영향을 미칠 수 있습니다. 휘발성 유기 용매를 첨가하여 표면 장력을 낮추면 감도가 향상됩니다. 양성자 친화도가 높은 계면활성제는 분무된 액적에서 이온 방출을 증가시키지만 동시에 감도를 감소시킬 수도 있습니다.

물에 포함된 10% DMSO 및 이소프로필 알코올과 같은 비양성자성 보조 용매(co-solvent)는 일부 화합물의 용해도를 개선합니다. 종종 포름산을 낮은 수준(0.1%)으로 첨가하면 분석물이 용매보다 높은 염기성을 갖게 함으로써 이온화가 촉진됩니다. 그러나 다른 불용성 화합물에 필요한 TFA와 같은 일부 산은 소량이라 할지라도 감도를 제한할 수 있습니다.

ESI 이온화 모드에서는 완충액과 염(Na⁺, K⁺ 및 인산염)이 증기압을 낮추고 결과적으로 신호를 감소시킵니다. 약한 산-염기 쌍으로 형성된 초산 암모늄과 같은 상대적으로 휘발성이 더 강한 완충액을 사용하면 액적의 증가한 표면 장력과 그에 따른 휘발성 감소를 해결할 수 있습니다.

용매 고려 사항

• 기체상의 용매는 ESI에 의한 이온화의 범위를 용매보다 염기성이 강한 분자로 제한합니다. 광이온화(산/염기 이온화가 아님)는 예외이지만 그럼에도 불구하고 용매에 의해 매개됩니다.
• 이온화 영역에서 용매와 수증기를 제거하면 대기압에서 이온화할 수 있는 화합물 유형이 늘어납니다.
• 액체에 포함된 샘플 또는 관심 분석 성분에 상대적으로 액체 부피를 줄이면 ESI 성능이 향상됩니다(즉, 낮은 유속).
• 유용한 용매
  • 물
  • 아세토니트릴
  • 메탄올
  • 에탄올
  • 프로판올
  • 이소프로판올
• 허용되는 첨가물
  • 아세트산
  • 포름산
  • 수산화 암모늄
  • 포름산 암모늄(염 농도 = 10mM 이하)
  • 초산 암모늄(염 농도 = 10mM 이하)
• 비휘발성 염(인산염, 붕산염, 구연산염 등)
  • 소스 및 플러그 모세관에 침착될 수 있으므로 더 잦은 청소 및 유지 관리 작업이 필요합니다
  • 최신 소스 설계는 이전 설계보다 비휘발성 물질을 더 잘 처리합니다.
• 표면 활성제(계면활성제/세제)는 전기 분무 이온화를 억제합니다.
• 무기산은 부식성 물질입니다.
• 트리플루오로아세트산(TFA)
  • 0.01%를 초과하는 수준에서 양이온 전자 분무를 어느 정도 억제합니다.
  • 음이온 전자 분무를 크게 억제합니다.
• 트리에틸아민(TEA)
  • 높은 PA(232Kcal/mole)는 m/z 102에서 강한 [M+H]+ 이온을 생성합니다.
  • 염기성이 낮은 화합물의 양이온 전기 분무를 억제합니다.
• 테트라히드로퓨란(THF)
  • 100% THF는 가연성이 높기 때문에 APCI와 대부분의 인터페이스 기술은 네뷸라이저 기체로 질소를 사용합니다. (공기를 사용하면 폭발 위험이 있습니다.)
  • PEEK 튜브와 반응합니다.

이온 억제 및 케미스트리 선택

이온 억제는 ESI를 이온화 기술로 사용하는 분광학자들이 직면한 가장 두드러진 문제 중 하나입니다. 미국 식품의약국(FDA)에서 발간한 간행물, Guidance for Industry on Bioanalytical Method Validation (Federal. Register, 66, 100, 28526) 2001년'에 따르면 분석 품질이 저하되지 않도록 하려면 이러한 고려가 필요합니다. 이 자료는 이온 억제의 존재 여부를 평가하기 위한 몇 가지 실험 프로토콜에 대해 설명합니다. 그중 한 프로토콜은 추출 후 스파이킹 샘플에 포함된 분석물의 다중 반응 모니터링(MRM) 반응(피크 면적 또는 피크 높이)을 순수한 이동상에 직접 주입된 분석물의 반응과 비교합니다. 순수 용매에 비해 매트릭스의 분석물 신호가 낮으면 간섭물질이  존재한다는 것을 나타냅니다.

C. Mallet 등이 발표한 자료에서는 크로마토그램에서 분석물(및 내부 표준물질)에 미치는 매트릭스 효과가 존재하는 위치를 설명합니다. 실험자는 관심 분석물과 컬럼 용리액에 추가된 내부 표준물질을 포함하는 표준 용액의 연속 흐름을 사용합니다. blank 샘플 추출물을 LC 시스템에 주입한 후, 베이스라인이 일정하게 떨어지면 간섭 물질의 존재로 인해 분석물의 이온화가 억제되었음을 나타냅니다.

컬럼 케미스트리

전환점을 마련한 기술 변화 중 하나는 하이브리드 컬럼 케미스트리와 직경이 sub 2μm인 매우 선택적인 입자의 등장입니다. 하이브리드 케미스트리는 이온 억제와 입자의 선택도 증가를 유발할 수 있는 이동상 변형제에 덜 의존합니다.

초고압 LC와 기존 HPLC 비교

J. Jorgenson 교수(노스캐롤라이나 대학교) 연구를 최근 상업화한, 일반적으로 UHPLC(초고압 액체 크로마토그래피)로 불리는 기술은 전형적인 LCMS 분석에서 도출된 정보를 늘릴 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. Waters Corporation에서 UPLC(초고성능 액체 크로마토그래피)로 상품화한 기술은 HPLC에 비해 피크 용량이 높아 HPLC의 넓은 피크에서 동시 용리되었을 화학적 대상물을 분리할 수 있습니다. 피크를 (일반적으로) 2초 이하의 너비 대역에 집중시키면 질량분석기가 신호 대 잡음비 개선에 더 잘 반응하도록 함으로써 감도를 높일 가능성이 높아집니다.

UPLC 개념은 유속, 입자 크기, 경우에 따라 van Deemter 곡선에 대한 평가까지 포함해 기존의 분리 방식에서 확립된 익숙한 파라미터를 바꿔놓습니다. 작동 압력이 약 2000psi에서 최대 20,000psi까지 증가하면 sub 2μm 입자 직경은 1969년 John Knox가 "Knox 방정식"에서 설명한 이론적인 한계에 접근하게 됩니다. 증가된 기계적 응력 및 과도된 열 효과와 같은 부수적인 문제가 해결되면서 MS 성능의 개선은 이론에 다소 대치되는 형태로 나타나고 있습니다.

기타 참고 문헌:

• C.R. Mallet, Z. Lu, and J.R. Mazzeo, A study of ion suppression effects in electrospray ionization from mobile phase additives and solid-phase extracts, Rapid Commun. Mass Spectrom. Vol 18, 1, 49–58 2004.
  • 이것이 중요한 이유: SPE 비교 문제를 다룰 때 자주 참조되는 연구입니다.
    
• L.L. Jessome, D. A. Volmer, Ion Suppression: A Major Concern in Mass Spectrometry, LCGC, Vol 24, 5 May 2006
  • 이것이 중요한 이유: ESI에서 직면하는 주요 장애물 중 하나로서 정량화에 영향을 주는 기체상 양성자 친화도 변화에 대해 포괄적으로 논의합니다.
    
• Toyo'oka, Toshimasa, Determination Methods for Biologically Active Compounds by Ultra-Performance Liquid Chromatography Coupled with Mass Spectrometry: Application to the Analyses of Pharmaceuticals, Foods, Plants, Environments, Metabonomics, and Metabolomics, Journal of Chromatographic Science, Vol 46, 3, March 2008, pp. 233-247
  • 이것이 중요한 이유: 최신 크로마토그래피 사례와 관련된 간행물의 포괄적 개요를 제공합니다.
    
• U. Neue, Theory of peak capacity in gradient elution, J Chromatogr A. 2005 Jun 24;1079 (1-2):153-61.
  • 이것이 중요한 이유: 최신 크로마토그래피 사례에 대한 현대적 시점에서 논의합니다.
    
• J. H. Knox and M. Saleem, Kinetic Conditions for Optimum Speed and Resolution in Column Chromatography, J. Chromatogr. Sci., 7 (1969) 614-622
  • 이것이 중요한 이유: 현대적 크로마토그래피 방식을 예측한 기초 논문 중 하나입니다.