액체 크로마토그래피 입문자 가이드

LC(액체 크로마토그래피)는 1900년대 초 러시아 식물학자인 Mikhail S. Tswett의 연구에 의해 정의되었습니다. 그의 선도적인 연구는 입자로 패킹된 컬럼에서 용매를 사용하여 식물에서 추출한 화합물[잎 색소]을 분리하는 데 중점을 두고 진행되었습니다.

Tswett은 개방형 유리 컬럼에 입자를 채웠습니다. 그가 유용성을 확인한 두 가지 재료는 분말 형태의 백악[탄산칼슘]과 알루미나였습니다. 그는 샘플[균질화된 식물 잎의 용매 추출물]을 컬럼에 붓고 입자 베드로 흘러나오도록 했습니다. 그 후에는 순수한 용매가 따라 나왔습니다. 샘플이 중력에 의해 컬럼을 통과할 때 일부 성분은 다른 성분보다 빠르게 움직이기 때문에 서로 다른 색상의 띠가 분리되는 것을 볼 수 있었습니다. 그는 이러한 분리된 서로 다른 색상의 띠를 샘플에 원래 포함되어 있던 화합물과 연관지었습니다. 그는 입자에 대한 각 화합물의 화학적 끌림의 차이를 이용해 이러한 화합물을 분석적으로 분리할 수 있었습니다. 입자에 더 강하게 끌리는 화합물은 속도가 느려지고 용매에 더 강하게 끌리는 다른 화합물은 더 빨리 움직입니다. 이 과정은 다음과 같이 설명할 수 있습니다. "샘플에 포함된 화합물은 이동상이라고 하는 이동 용매와 고정상이라고 하는 입자 사이에 다르게 분포하거나 분배됩니다. 이로 인해 각 화합물이 다른 속도로 이동하여 최종적으로 분리됩니다."

Tswett은 색상을 이용한 자신의 실험을 설명하기 위해 크로마토그래피[색을 의미하는 그리스어 chroma와 쓰기를 의미하는 graph에서 유래하며, 말 그대로 색을 쓴다는 의미]라는 이름을 지었습니다. [놀랍게도 러시아 이름 Tswett은 색을 의미합니다.] 오늘날 다양한 형태의 액체 크로마토그래피는 분석 화학에서 가장 강력한 도구 중 하나가 되었습니다. 

기술 2.그림 C는 종이[고정상]에 샘플을 점적한 모습을 보여줍니다. 그런 다음 용매[이동상]를 중앙에 추가하여 바깥쪽으로 향하는 흐름을 생성합니다. 이것은 종이 크로마토그래피의 한 형태입니다. [전통적인 종이 크로마토그래피는 선형 흐름의 TLC와 유사한 방식으로 수행됩니다.] 상단 이미지는 동일한 검정색 FD&C 염료 샘플을 종이에 점적한 모습입니다.

TLC 플레이트와 종이의 분리능 차이를 비교해 보십시오. 녹색 고리는 종이가 노란색과 파란색 염료를 서로 분리할 수 없지만, 이러한 염료를 빨간색 염료로부터는 분리할 수 있음을 나타냅니다. 하단 이미지에는 동일한 노란색 및 파란색 염료로 구성된 녹색 샘플이 용지에 점적되었습니다. 예상대로 종이는 두 염료를 분리할 수 없습니다. 중간에 빨간색과 파란색 염료로 구성된 보라색 샘플이 종이에 점적된 모습이 보입니다. 이 염료들은 잘 분리되어 있습니다.

기술 3. 가장 강력한 접근 방식인 이 방법에서는 샘플이 적절한 입자[고정상]를 포함하는 컬럼이나 카트리지 장치를 통과합니다. 이러한 입자를 크로마토그래피 충전재라고 합니다. 용매[이동상]가 장치를 통해 흐릅니다. 고체상 추출[SPE]에서 샘플이 카트리지에 로드되고 용매 흐름을 타고 샘플이 장치를 통과합니다. Tswett의 실험에서와 같이 샘플의 화합물이 장치를 통과하면서 각기 다른 속도로 이동하여 분리됩니다. 여기서는 검정색 샘플이 카트리지에 로드됩니다. 분리를 생성하기 위해 각 단계에서 서로 다른 용매가 사용됩니다.

카트리지 형식을 사용할 경우, 흐름을 생성하는 몇 가지 방법이 있습니다. 중력 또는 진공은 압력을 견디도록 설계되지 않은 컬럼에 사용할 수 있습니다. 일반적으로 이 경우 입자 직경이 더 커서[> 50μm] 흐름에 대한 저항이 적습니다. 개방형 유리 컬럼[Tswett의 실험]이 그 예입니다. 또한, 일반적으로 실린지 몸통 모양의 작은 플라스틱 컬럼을 충전재 입자로 채우고 샘플 전처리를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이것을 고체상 추출[SPE]이라고 합니다. 여기에서 카트리지라고 하는 크로마토그래피 장치는 일반적으로 진공 보조 흐름과 함께 사용되어 추가적인 분석 전에 매우 복잡한 샘플을 클린업합니다.

더 작은 입자 크기[< 10μm]는 분리능을 향상시키는 데 필요합니다. 그러나 작은 입자는 흐름에 대한 저항이 더 크므로 원하는 용매 유속을 얻으려면 더 높은 압력이 필요합니다. 이를 위해 고압을 견디도록 설계된 펌프와 컬럼이 필요합니다. 중간 내지 높은 압력을 사용하여 용매를 크로마토그래피 컬럼에 통과시키는 기술을 HPLC라고 합니다.

HPLC(고성능 액체 크로마토그래피) 개요

고 Csaba Horváth 교수가 1970년 Pittcon 논문에서 처음 사용한 용어인 HPLC는 충전된 컬럼에서 액체 크로마토그래피에 필요한 흐름을 생성하기 위해 고압(high pressure)을 사용했다는 것을 의미합니다. 처음에는 펌프의 압력이 500psi[35bar]에 불과했습니다. 이를 고압 액체 크로마토그래피 또는 HPLC라고 합니다. 1970년대 초에는 기술 수준이 엄청나게 도약했습니다. 새로운 HPLC 기기는 최대 6,000psi[400bar]의 압력까지 견디도록 개발되었으며 개선된 주입기, 검출기 및 컬럼이 도입되었습니다. HPLC는 1970년대 중반에서 후반 사이에 자리를 잡기 시작했습니다. 이 기간 동안 성능의 지속적인 발전으로[더 작은 입자, 더 높은 압력] HPLC라는 약어명은 그대로 유지되었지만 전체 이름은 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)로 바뀌었습니다.

고성능 액체 크로마토그래피는 이제 분석 화학에서 가장 강력한 도구 중 하나입니다. 이 기술로 액체에 용해될 수 있는 모든 샘플에 존재하는 화합물을 분리, 식별 및 정량화할 수 있습니다. 오늘날에는 ppt만큼 낮은 미량 농도의 화합물을 쉽게 식별할 수 있습니다. HPLC는 의약품, 식품, 건강보조제, 화장품, 환경 매트릭스, 법의학 샘플 및 산업용 화학물질 등 거의 모든 샘플에 적용할 수 있고 실제로 적용되고 있습니다.

UPLC(초고성능 액체 크로마토그래피) 기술 개요

2004년에는 기기 및 컬럼 기술이 더욱 발전하여 액체 크로마토그래피의 분리능, 속도 및 감도가 크게 향상되었습니다. 새로운 차원의 성능을 달성하기 위해 더 작은 입자[1.7μm]의 컬럼과 15,000psi[1,000bar] 압력에서 이동상을 전달하도록 설계된 특수 기능을 갖춘 기기가 필요했습니다. 현재 UPLC 기술로 알려진 초고성능 액체 크로마토그래피를 수행하려면 총체적으로 새로운 시스템을 개발해야 했습니다.

오늘날에는 1μm 정도로 직경이 작은 입자가 채워진 컬럼과 100,000psi[6,800bar]에서 작동할 수 있는 기기를 이용해 분석자들이 기본적인 연구를 수행하고 있습니다. 이를 통해 미래에 어떤 가능성이 열려 있는지 가늠해 볼 수 있습니다.